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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
1
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.1
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
10
页，第
1
页
研究论文
Research Article
PCR
产物直接测序和混合克隆测序进行桉树
EST-SSR
标记开发
周长品
,
李发根
,
翁启杰
,
于晓丽
,
李梅
,
甘四明
中国林业科学研究院热带林业研究所
,
广州
, 510520
通讯作者及电子邮件
: Siming.Gan@ritf.ac.cn;
作者
分子植物育种
, 2010
年
,
第
8
卷
,
第
1
篇
DOI: 10.5376/mpb.cn.2010.08.0001
收稿日期：
2010
年
7
月
12
日
接受日期：
2010
年
9
月
10
日
发表日期：
2010
年
9
月
12
日
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,
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周长品等
, 2010, PCR
产物直接测序和混合克隆测序进行桉树
EST-SSR
标记开发
,
分子植物育种
Vol 8 No 1 (DOI: 10.5376/mpb.cn.2010.08.0001)
摘
要
EST-SSR
标记开发中，合适的测序方案是保障序列质量、控制实验成本和提高实验效率的关键。本研究利用
1
株细
叶桉
(P
2
)
对
PCR
产物大小不同的
32
个桉树候选
EST-SSR
标记进行了
PCR
产物直接测序和混合克隆测序的比较。
PCR
产物
直接测序成功的标记有
21
个
(65.6%)
，但有
4
个标记因简单重复序列邻近测序引物未能确认重复单位数、
8
个标记因在
P
2
中等位片段长度杂合而在重复单位后面的测序峰图中显示双峰。在
8
个、
16
个、
24
个和全部
32
个
EST-SSR
对
P
2
的
PCR
产
物的混合克隆测序中，测序成功的标记分别为
6
个
(75.0%)
、
11
个
(68.8%)
、
11
个
(45.8%)
和
14
个
(43.8%)
。综合考虑克隆转化
与测序的效率、成本和时间，推荐
16
个
PCR
产物为混合克隆测序的最佳数量。本研究中共有
27
个桉树
EST-SSR
标记成功
测序，与源
EST
比对的序列一致性介于
90.23%
和
100%
之间，包括在
P
2
中片段长度杂合的标记
10
个、纯合的
17
个；在长
度纯合的
17
个标记中，有
8
个在
P
2
中存在
1
个以上的个体内
SNP
。
关键词
桉树
, EST-SSR,
直接测序法
,
混合克隆测序法
Comparison between direct sequencing and pool-cloning-based sequencing of
PCR products in EST-SSR marker development in
Eucalyptus
Changpin Zhou , Fagen Li , Qijie Weng , Xiaoli Yu , Mei Li , Siming Gan
Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou, 510520,China
Corresponding author, siming.gan@ritf.ac.cn;
Authors
Abstract
An appropriate sequencing protocol is critical in terms of sequence quality, cost effectiveness and efficiency. In the
present study, a total of 32 candidate EST-SSR markers varying in PCR product size against an
Eucalyptus tereticornis
individual(P
2
) were used for PCR product direct sequencing and pool-cloning-based sequencing. In PCR product direct sequencing
with P
2
, 21 (65.6%) markers were successfully sequenced. Four of them had only partial repeat motifs validated due to their
closeness to the (forward) sequencing primer, and eight of them which were length-heterozygous showed double peaks behind the
repeats in the sequencing traces. Pool-cloning of 8, 16, 24 and 32 EST-PCR products resulted in 6 (75.0%), 11 (68.8%), 11 (45.8%)
and 14 (43.8%) markers reliably sequenced, respectively. Considering the efficiency as well as cost and time inputs, it is
recommended that pool-cloning of 16 EST-PCR products is the best option. Totally 27 eucalypt EST-SSR markers were validated in
this study, with an identity with the original EST between 90.23% and 100%, out of which 10 were length-heterozygous in P
2
and 17
were homozygous, including 8 each containing at least one within-individual SNP.
Keywords
Eucalyptus
, EST-SSR, Direct sequencing, Pool-cloning-based sequencing
研究背景
桉树是桃金娘科
(Myrtaceae)
桉属
(
Eucalyptus
)
、
杯果木属
(
Angophora
)
和伞房桉属
(
Corymbia
)
树种的
简称，共有
808
种和
137
个变种
(Hill and Johnson,
1995)
。桉树的天然分布主要是澳大利亚、巴布亚新
几内亚和印度尼西亚及其附近岛屿，因其具有速
生、丰产、适应性广和用途多样等特点，在热带和
亚热带地区广为引种，全球人工桉树林面积已达
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