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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
1
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.1
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
10
页，第
5
页
1.4
桉树
EST-SSR
标记的开发
结合对细叶桉
P
2
的
PCR
产物直接测序和混合
克隆测序，共确认了
27
个桉树
EST-SSR
的序列，与
源
EST
比对的一致性介于
90.23%
和
100%
之间
(
表
1)
。
其中，在
P
2
中片段长度杂合的标记
10
个、纯合的
17
个；在长度纯合的
17
个标记中，有
8
个
(02
、
03
、
04
、
05
、
10
、
14
、
23
和
26
号
)
存在
1
个以上的个体内
SNP
。
2
讨论
目前，新一代的测序技术已有广泛的应用
(Mardis, 2008)
，但传统的末端终止法仍是普遍使用
的测序技术
(
周德贵等
, 2008)
，尤其是针对小规模的
目的序列的测序，如
EST
标记开发中的
EST-PCR
产物测序。因此，如何经济、快捷和高效地进行末
端终止法测序仍然具有极为重要的应用价值。
PCR
产物直接测序具有快速、简便和低成本的
优点
(
徐祖元等
, 2002;
张晓红等
, 2009)
；并且，对
于二倍体的
DNA
模板，可以同时测出
2
个等位片
段
(
虽然存在插入
/
缺失时后面测序峰会出现双峰
)
。
但是，因技术限制，
PCR
产物直接测序时前面
30~40
bp
左右往往遗失
(
苑克俊等
, 2007)
，这不利于完整序
列的确认，尤其是目的序列靠近测序引物位置时，
如本研究中
SSR
重复单位未能完整判读的
4
个标记；
并且，当
DNA
模板的引物结合序列发生变异时，引
物特异性较差将导致非特异性
PCR
产物的产生，测
序的峰图较乱，影响测序结果判读的准确性
(
张晓红
等
, 2009)
，这也是本研究中尚有
11
个
(34.4%)
扩增较
好的
EST-SSR
标记未能成功测序的主要原因。因此，
PCR
产物直接测序主要应用于扩增特异性好、测序
引物后面的几十个碱基不需完整确认的序列。
克隆测序可以克服
PCR
产物直接测序的不足，
获得完整序列
(
毛伟华
, 2005)
。但是，以往的克隆测
序多是针对单个
PCR
产物，这在待测样品较多时需
要花费大量的经费和人力进行克隆转化，因此多个
PCR
产物混合克隆应是一个不错的选择。本研究中
混合克隆测序的成功率为
43.8~75.0%
，并且有
6
个
标记只在混合克隆中被成功测序，证明了混合克隆
测序的有效性。
比较
8
个、
16
个、
24
个和
32
个
EST-PCR
产物
混合克隆后的测序成功率，兼顾克隆转化与测序的
效率、成本和时间，我们推荐
16
个
EST-PCR
产物
混合克隆为最好的选择。混合克隆的
PCR
产物太
少，克隆转化的成本较高、耗时也较多。
PCR
产物
太多，非特异性扩增的谱带数增加
(
虽然切胶回收法
可以解决这一问题，但增加成本和人力
)
，菌落
PCR
后通过片段长度查找对应的
PCR
产物时易与长度
近似的目的片段混淆，从而造成测序的浪费，如本
研究
32
个
EST-PCR
产物的混合克隆中
32
次测序只
确认了
14
个标记；并且，
PCR
产物增多，产物间
长度差别相对较小，菌落
PCR
后通过琼脂糖凝胶电
泳不易准确查找对应长度的
EST-PCR
产物
(
尤其对
于长片段
)
。当然，在实际实验中，再挑取更多的菌
落测序可以获得更多的标记，但增加了菌落
PCR
与
测序的工作量和成本。
目前，已发表的桉树
EST-SSR
标记只有
20
个，
且未进行测序确认
(Faria et al., 2010)
。本研究共开发
了与源
EST
序列一致性好的
27
个桉树
EST-SSR
标
记
(
表
1)
，这将显著增加桉树的分子标记资源。并且，
27
个标记中，在
P
2
中存在片段长度杂合的标记有
10
个、存在个体内
SNP
的标记有
8
个，这些标记
将在以
P
2
为父本的遗传图谱构建群体中分离，从而
有效用于遗传图谱构建。这也表明在桉树中开发基
于
EST
的分子标记具有极大潜力。
3
材料与方法
3.1
实验材料与
DNA
提取
1
株细叶桉
(P
2
)
是
Gan
等
(2003)
遗传图谱构建群
体的父本。
DNA
提取参考
CTAB
法
(Doyle and Doyle,
1991)
，稍做改进，即在
CTAB
提取液中加入
5%
的
聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)
和
2%
的
β
-
巯基乙醇。
pGEM®-T Easy
载体及
JM109
大肠杆菌感受态细胞
购自
Promega
公司。
3.2 EST
序列、引物序列和
PCR
桉树
EST
序列下载自
GenBank (http://www.nc
bi.nlm.nih.gov/projects/dbEST/)
，截止
2009
年
1
月
2
日共有
35 643
条。利用
PHRAP
软件
(http://bozeman.
mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)
拼接后，通
过
MISA
软件
(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)
查
找简单序列重复，标准为：
2
、
3
和
4
碱基重复的最