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分子植物育种
(
网络版
), 2010
年
,
第
8
卷
,
第
1
篇
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2010, Vol.8, No.1
http://mpb.
5th
.sophiapublisher.com
共
10
页，第
6
页
短长度为
12 bp
，
5
和
6
碱基为
15 bp
。包含
SSR
的
序列用于
EST-SSR
引物设计，软件为
Primer Premier
5.0
，标准为：引物长度
18~22 bp (
最佳
20
bp)
，
T
m 55~65
℃ (最佳
60
℃)，
GC
含量
40~60 %
，
目的片段长度
100~500 bp
。引物合成委托上海
Invitrogen
公司完成。
利用细叶桉
(P
2
) DNA
进行
EST-SSR
引物的
PCR
条件优化，主要针对
PCR
体系的
Mg
2+
浓度和
PCR
程序的退火温度。
PCR
优化后，选择
PCR
产
物长度不同的
32
个
EST-SSR
进行测序实验，引物
序列和
PCR
产物大小见表
1
。
PCR
体系和
PCR
程
序参考张晓红等
(2009)
，退火温度均为
56
℃，但
10
×
Buffer
中
Mg
2+
浓度改为
15
或
20 mmol/L
。
3.3 PCR
产物纯化和直接测序
PCR
产物经乙醇
-
醋酸钠法纯化后直接测序
(
张
晓红等
, 2009)
，测序一般利用前向引物，对较长片
段也利用后向引物测序。测序采用
20
µ
L
体系，参
考
Bigdye Terminator V3.1
操 作手 册
(Applied
Biosystems Co.)
，但测序试剂
Bigdye
用量为
0.5
µ
L
。
测序仪为
ABI 3130xl
，数据收集利用软件
Data
Collection 2.0
， 序 列 查 看 和 分 析 利 用 软 件
Sequencing Analysis 5.2
。所测序列与目标
EST
序列
的比对利用软件
DNAMAN V5.2.2 (Lynnon Biosoft,
Quebec, Canada)
。
3.4
PCR
产物的混合克隆和测序
对于候选
32
个桉树
EST-SSR
标记，按照对细
叶桉
P
2
扩增产物长度的相互差别尽量较大的原则，
分别选取
8
个
(04
、
06
、
08
、
12
、
15
、
17
、
22
和
26
号
)
、
16
个
(01
、
04
、
06
、
08
、
10
、
11
、
13
、
16
、
17
、
20
、
22
、
23
、
24
、
26
、
28
和
29
号
)
、
24
个
(
去除
02
、
05
、
09
、
13
、
14
、
18
、
22
和
32
号
)
以及全部
32
个
标记的
PCR
产物进行等摩尔混合，并利用载体
pGEM®-T Easy (Promega)
进行克隆、通过热激法转
化
JM109
感受态细胞，转化细胞在含有
X-gal/IPTG
的
LB
固体培养基上进行蓝白斑筛选。操作过程按
照试剂盒的说明。
从培养平板上挑取
6
倍于原
PCR
产物数量的阳
性 菌 落 进 行
PCR
， 引 物 为
pUC/M13-F
(5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3')
和
pUC/M13-R
(5'-TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3')
。
PCR
体
系参考张晓红等
(2009)
，但
10
×
Buffer
中
Mg
2+
浓度
为
20 mmol/L
；
PCR
程序为
95
℃
5 min
，再
30
个循
环：
94
℃
30 s
、
55
℃
30 s
、
72
℃
3 min
，最后
72
℃
10
min
。根据菌落
PCR
产物大小
(
减去载体序列
253 bp)
确定最可能对应的原
EST-PCR
产物，针对各个最可
能插入了原
EST-PCR
产物的菌落进行测序，即各批
测序的克隆数等于混合的标记数量。测序过程参考
前
3.3
。所测序列与目标
EST
序列的比对利用软件
DNAMAN V5.2.2 (Lynnon Biosoft)
。
作者贡献
周长品和李发根是本研究的实验设计和实验研究的执
行人；翁启杰和于晓丽及李梅参与实验执行以及结果分析；
甘四明是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，
论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金
(31070592)
、广东省自然科
学基金
(10151052001000000)
、国家高技术研究发展计划
(863
计划
)
重点项目
(2006AA100109)
和中央级公益性科研院所基本
科研业务费专项
(RITFKYYW2008
-
4
和
2010
-
04)
共同资助。
参考文献
Ayers N.M., McClung A.M., Larkin P.D., Bligh H.F.J., Jones
C.A., and Park W.D., 1997, Microsatellites and a single
nucleotide polymorphism differentiate apparent amylose
classes in an extended pedigree of US rice germplasm,
Theor, Appl. Genet., 94(6-7): 773-781
Brondani R.P.V., Williams E.R., Brondani C., and Grattapaglia
D., 2006, A microsatellite-based consensus linkage map for
species of
Eucalyptus
and a novel set of 230 microsatellite
markers for the genus, BMC Plant Biol., 6: 20
Ceresini P.C., Silva C.L.S.P., Missio R.F., Souza E.C., Fischer
C.N., Guillherme I.R., Gregorio I., da Silva E.H.T.,
Cicarelli R.M.B., da Silva M.T.A., Garcia J.F., Avelar
G.A., Neto L.R.P., Marcon A.R., Junior M.B., and Marini
D.C., 2005, Satellypus: analysis and database of
microsatellites from ESTs of
Eucalyptus
, Genet. Mol.
Biol., 28(3s): 589-600
Cha R.S., and Thilly W.G., 1995, Specificity, efficiency, and
fidelity of PCR. In: Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S.
(eds.), PCR primer: a laboratory manual, Cold Spring