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癌症与分子诊断研究(网络版), 2012 年, 第 1 卷, 第 3 篇，第 12-16 页
Aizheng Yu Fenzi Zhenduan Yanjiu (Online), 2012, Vol.1 No.3, 12-16
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哪条途径？通过利用 Western Blotting 技术检测
mTOR 激酶的磷酸化水平及 Beclin 1 的表达水平，
发现 16HBE-T 细胞比 16HBE-N 细胞 mTOR 激酶的
磷酸化水平高，而 Beclin 1 的表达水平是降低的(图 3)，
证明恶性转化 16HBE 细胞过程中两个自噬调控的
主要通路均被激活，提示自噬可能通过多条途径参
与了肺细胞癌变的过程。
图 3 mTOR 激酶的磷酸化及 Beclin 1 的表达水平
Figure 3 The phosphorylation of mTOR kinase and expression
level of Beclin 1
2 讨论
职业暴露镍化合物人群的暴露途径主要是呼
吸道。由于永生化人支气管上皮细胞株 16HBE 与
人支气管上皮细胞的生物学特性基本相似，因此本
研究采用的结晶型 NiS 恶性转化人永生化支气管上
皮细胞株 16HBE，作为研究肺癌发生模型具有良好
的代表性(刘林华等, 2010)。我们前期研究已经建立
了结晶型 NiS 诱导人支气管上皮细胞(16HBE)发生
恶性转化的动态模型，利用该模型已经证明肺癌细
胞的生物学发生是一个十分复杂的过程，但其具体
的致癌机制仍需进一步研究。据目前报道的研究发
现，自噬在多种人类肿瘤中均存在活性的改变，且
在肿瘤发生、发展的过程中扮演了双重角色，既能
抑制肿瘤又能促进肿瘤细胞的生存，因此正确调控
自噬途径可能成为预防和治疗肿瘤的新方法(Chen
and Karantza, 2011)。Pandit 等(2011)最新报道称自
噬途径也可能参与了肺细胞的癌变。
为此，本研究利用前期研究建立的结晶型 NiS
诱导 16HBE 发生恶性转化的动态模型，首先采用
激光共聚焦扫描显微镜成像技术，在无损伤状态
下，实时观测活细胞中 LC3 蛋白的荧光强度及定
位，结果发现 16HBE 细胞恶性转化后自噬水平会
明显降低(图 1)，几乎只有未转化细胞的 1/3 水平，充
分证明了自噬途径参与了结晶型 NiS 诱导肺细胞癌
变的过程。Western Blotting 技术检测 mTOR 激酶的
磷酸化水平及 Beclin 1 的表达水平，结果发现 16HBE-T
细胞比 16HBE-N 细胞 mTOR 激酶的磷酸化水平高，
而 Beclin 1 的表达水平降低(图 2)，证明结晶型 NiS
恶性转化 16HBE 细胞过程中两个自噬调控的主要
通路均被激活。
综上说述，我们证明了结晶型 NiS 可通过依赖
mTOR 激酶和不依赖 mTOR 激酶自噬途径参与诱导
16HBE 细胞恶性转化的癌变过程，这个结果不但可
以确定自噬途径在参与癌变过程中的重要性，还说
明其复杂性，由于调控这两个途径的上下游信号分
子比较多，因此要明确自噬在肺细胞癌变过程中的
分子机制从而达到预防和治疗肺癌的目标，需要我
们进一步的研究。
3 材料与方法
3.1 实验材料和仪器
细胞系为结晶型 NiS 恶性转化细胞 16HBE-T。
经形态学观察、软琼脂培养及裸鼠成瘤试验证实已
经恶性转化；非转化对照细胞 16HBE-N，均由本实
验室建立 ( 纪卫东等 , 2002) 。 MEM 培养基购自
GIBCO 公司，p-mTOR 和 Beclin1 抗体购自 Cell Sign-
aling Technology 公司，β-actin 抗体购自 santa 公司，
LipofectamineTM 2000 Reagent 购自 Invitrogen 公司，
其它所有试剂均为国产分析纯。质粒 GFP-LC3 惠赠
于 Professor Marja Jäättelä (Rammer et al., 2010)。
激光共聚焦扫描显微镜 (LSM 510/ConfoCor2)及
双色红外荧光系统 ODYSSEY® Infrared Imaging
System 是德国 Zeiss 公司和美国莱卡公司产品。
3.2 细胞培养
16HBE-N 和 16HBE-T 细胞置于含 10%小牛血
清的 MEM 培养基中培养，根据实验要求接种不同
密度的细胞于培养皿或者培养瓶中，置 37℃，5% CO2
的培养箱中培养，每隔 48 h 换一次液。
3.3 细胞转染
取对数生长期的 16HBE-N 和 16HBE-T 细胞接
种在 35 mm 直径的特制细胞培养皿内(由本实验室
自制)，待细胞达到 70%~80%融合时，用 Lipofectam-
ineTM 2000 转染试剂按说明将 GFP-LC3 质粒转染至
16HBE-N 和 16HBE-T 细胞，转染 4 h 后换液，分别
于培养 24 h、48 h 和 72 h 后置于激光共聚焦扫描显微
镜下观察 GFP-LC3 的表达情况(Yang et al., 2007)。
3.4 激光共聚焦扫描显微镜检测
转染后的 16HBE-N 和 16HBE-T 细胞均在 Zeiss
公司 LSM 510 型激光共聚焦扫描显微镜上采用 100