Page 6 - cmdr-Vol.01-No.03

Basic HTML Version

癌症与分子诊断研究
(
网络版
), 2012
,
1
,
3
篇,第
12
-
16
Aizheng Yu Fenzi Zhenduan Yanjiu (Online), 2012, Vol.1 No.3, 12
-
16
http://cmdr.5th.sophiapublisher.com
13
肺癌是最常见的恶性肿瘤,在男性中其发病率
和死亡率都已跃居各种恶性肿瘤之首
(Jemal et al.,
2011)
。大量研究表明:镍化合物是经过人类呼吸道
的重要致癌物,广泛存在于人类职业环境中。国际
癌症研究机构
(IARC)
早在
1987
年就将镍及其化合
物确认为第一类致癌物
(
刘林华等
, 2010)
,但其致癌
的分子机制仍不清楚。我们前期研究已证实金属毒
物镍的暴露是发生肺癌的重要病因,并建立了结晶
型硫化镍
(NiS)
诱导人支气管上皮细胞
(16HBE)
发生
恶性转化的动态模型,但具体的致癌机制仍未明了
(
纪卫东等
, 2002; Ji et al., 2008)
自噬
(autophagy)
是细胞利用溶酶体降解自身受
损的细胞器和大分子物质的过程,被称为Ⅱ型程序
性死亡,是真核细胞特有的生命现象
(Edinger and
Thompson, 2004)
。近年来,随着对自噬研究的不断
深入,其在肿瘤中的作用日渐引起广泛关注。有报道
称在肺癌临床样本中检测到自噬相关基因
Beclin 1
表达的下调
(Liu et al., 2008)
,但由于采取的研究手
段有限,自噬途径具体的作用机制还很不清楚。目
前文献报道调控哺乳动物自噬主要的信号通路有
两大类:第一类为依赖
mTOR (mammalian target of
rapamycin)
激酶途径:
mTOR
激酶调节细胞生长,
可抑制自噬的发生,是自噬的负调控分子
(Yang et al.,
2005)
mTOR
激活后会磷酸化
Atg13
,使得
Atg13/
Atg1/Atg7
复合体解体,消弱
Atg1
激酶的活性从而
阻止自噬的启动
(Maiuri et al., 2007)
。第二类为不依赖
mTOR
激酶途径:酵母
Atg6
同源蛋白
Beclin 1
是细
胞自噬过程中最重要的正调节因子,通常结合
Class
PI3K
形成复合体诱导自噬
(Kihara et al., 2001)
为了研究自噬途径在肺上皮细胞癌变中的作
用机制,本研究拟利用前期建立的细胞恶性转化模
型,主要采用激光共聚焦扫描显微镜成像技术,在
无损伤状态下,实时观测活细胞中自噬体标记蛋白
GFP-LC3
的荧光强度及定位,并利用
Western Blotting
技术检测细胞内自噬信号通路关键效应分子的表
达。以期初步从细胞自噬现象的发生、发展的角度
研究肺细胞癌变的分子机制,为肺癌的预防和治疗
提供科学依据。
1
结果与分析
1.1
实时检测自噬在活细胞
16HBE-N
16HBE-T
中的产生
为了确定自噬途径参与了肺上皮细胞的癌变,
可以通过检测正常细胞和恶性转化细胞中自噬体
的数目来判断。本研究利用激光共聚焦扫描显微镜
在单个活细胞中实时观测
LC3
蛋白的时空动态变
化,发现在
GFP-LC3
转染
24 h
的时候,只有少量
的荧光细胞,继续培养到
48 h
后荧光细胞开始增
多,通过观测发现
16HBE-T
细胞中成点状聚集的
GFP-LC3
的数量比
16HBE-N
细胞中的数量明显减
少,培养至
72 h
后结果类似
(
1)
。经过显微镜下
随机选择多个细胞进行统计测量,发现
16HBE-N
胞的点状聚集个数远远多于
16HBE-T
细胞
(
2)
。这
个结果证明
16HBE
细胞恶性转化后自噬水平会明
显降低,说明在肺细胞癌变过程中自噬水平会发生
改变,因此可以推测自噬是肺细胞癌变的重要机制。
1.2 16HBE-N
16HBE-T
细胞中
mTOR
激酶的磷
酸化水平及
Beclin 1
的表达水平
哺乳动物自噬主要的信号通路有依赖
mTOR
激酶和不依赖
mTOR
激酶两大途径。本研究通过检
GFP-LC3
的定位情况已经知道
16HBE-T
细胞的
自噬水平比
16HBE-N
细胞的自噬水平要明显降低,
因此下一步希望可以明确自噬水平降低经过的是
1
激光共聚焦扫描显微镜下观测正常细胞和恶性转化细胞
GFP-LC3
的定位
Figure 1 Confocal laser scanning microscopy for the GFP-LC3
location of normal (16HBE-N) and malignant transformedcells
(16HBE-T)
2
细胞中
GFP-LC3
点状聚集的个数
: 16HBE-T
细胞组与
16HBE-N
细胞组比较
:
*P
<0.001, (n=10)
Figure 2 The number of punctate protein aggregation in the cell
Note: Comparison of 16HBE-T cells group and 16HBE-N cells
group:
*P
<0.001, (n=10)
5TH