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癌症与分子诊断研究
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
3
篇，第
12
-
16
页
Aizheng Yu Fenzi Zhenduan Yanjiu (Online), 2012, Vol.1 No.3, 12
-
16
http://cmdr.5th.sophiapublisher.com
15
倍油镜检测，记录的图像和数据采用
Zeiss Rel3.2
软件系统进行分析。在本实验中，采用
488 nm
的
氩离子激光作为
GFP
的激发光源，
GFP
的吸收滤
色镜选用
BP5002550
。
3.5 Western Blotting
检测
分别收集对数生长期的
16HBE-N
和
16HBE-T
细胞，用预冷的
PBS
清洗两次，采用
PMSF
裂解液
并添加
1×protease inhibitor cocktail set
Ⅰ在冰上振
荡裂解细胞后，用
Bradford
法进行蛋白定量。取相
同含量的蛋白，在
12% SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳中
进行蛋白分离
2 h
，电泳后采用
100 V
恒压
1 h
将蛋
白电转膜至硝酸纤维素膜；印迹膜在含有
5%
封闭蛋
白的
TBS-T
缓冲液中封闭
1 h
；在
p-mTOR
、
Beclin 1
和
β-actin
的一抗溶液
(
抗体用
5%
封闭蛋白的
TBS-T
缓冲液
1: 1 000
稀释
)
中
4
℃过夜孵育。次日加入耦
联有
IRDye800
和
Alexa Fluor 680
的荧光二抗，通
过双色红外荧光系统进行
mTOR
激酶的磷酸化水平及
Beclin 1
的表达水平检测
(
张岚和邢达
, 2010)
。
3.6
统计学处理
每种实验至少重复
3
次，实验数据以
mean±SEM
表示，采用
t
检验确定处理组和对照组之间的差异。
*P
<0.001
为显著性差异有统计学意义。
作者贡献
张岚为实验完成人和文章写作人；吕嘉春为实验和文章
写作指导人；杨磊协助完成整体实验。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目
(81102159, 81072366,
30872178)
； 广 东 省 自 然 科 学 基 金 博 士 启 动 项 目
(S2011040003622)
；广东省高层次人才项目
(2010
-
79)
、广东高
校优秀青年创新人才培养计划项目
(2009
-
7)
和广州市科技和
信息化局应用基础研究计划项目
(12C22021629)
共同资助。
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