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癌症与分子诊断研究(网络版), 2012 年, 第 1 卷, 第 7-11 页
Aizheng Yu Fenzi Zhenduan Yanjiu (Online), 2012, Vol.1, 7-11
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环节抑制 HIV-1 复制，可能为 HIV/AIDS 防治提供
一种全新的思路。
图 6 转染 vMIP-Ⅰ后 Jurkat 细胞中后 A3G, A3F, CCL5, MX1
和 MX2 基因的表达水平
Figure 6 Expression levels of A3G, A3F, CCL5, MX1 and MX2
genes in Jurkat cells transfected by vMIP-Ⅰ
3 材料与方法
3.1 菌种、质粒和细胞株
菌株 E. coli DH5a、真核表达载体 PEGFP- N3、
Jurkat 细胞均为本实验室保存；含有 vMIP-Ⅰ基因的
Cosmid Z6 为美国匹兹堡大学的 Chang Y 教授惠赠。
3.2 工具酶及试剂
T4 DNA 连接酶，Taq DNA 聚合酶为 Biolabs
公司产品；限制性内切酶限 XhoⅠ和 BamHⅠ为
Fermentas 公司产品；无内毒素质粒大提试剂盒，
总 RNA 抽提试剂盒及 DNA Mark 购于北京天根生
化科技有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒购于广州
东盛生物有限公司；逆转录试剂盒、实时定量试
剂盒购于 TaKaRa 公司； RPMI-1640 培养液购于
HyClone 公司；胎牛血清购于 Gibco 公司；引物由
上海生物工程有限公司合成，其余常规试剂均为
进口或国产分析纯。
3.3 目的基因的 PCR 扩增
根据 KSHV K6 基因序列设计引物，于引物的
5’端分别引入 BamHⅠ及 XhoⅠ限制性内切酶位
点。上游引物 P1 序列：5’-CATCTCGAGATGGCC
CCCGTCCACGT-3’(下划线为 XhoⅠ酶切位点)；下
游引物 P2 序列：5’-CATGGATCCCTAAGCTATGG
CAGGC-3’ (下划线为 BamHⅠ酶切位点)。扩增产
物预期长度为 297 bp。
以 Cosmid Z6 为模板，以 P1 和 P2 引物进行扩
增。PCR 反应总体积为 25 μL：2.5 mmol/L dNTPs
2 μL，10×Buffer with MgSO4 2.5 μL， 10 μmol/L 引物
P1，P2 各 1 μL，Z6 模板 3 μL，Taq DNA 聚合酶
0.25 μL，ddH2O 15.25 μL。反应条件：94℃预变性
8 min，94℃变性 30 s，59℃退火 30 s，72℃延伸
30 s，热循环 35 cycles，最后 72℃延伸 10 min。
2.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条带为扩增目的片段
长度，根据 DNA 凝胶回收试剂盒操作步骤切胶回
收 PCR 产物。
3.4 真核表达质粒 pEGFP-N3-vMIP-Ⅰ的构建及鉴定
将上述切胶回收产物与载体 pGEM-T easy 在
T4 连接酶的作用下于 4℃连接过夜，将连接产
物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，并在含有
100 μg/mL 氨苄青霉素的 T-A 克隆平板上进行蓝白
斑筛选，挑取白色阳性菌落摇菌并抽取质粒，
Bam HⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定，将初步鉴定为阳性
的质粒送上海生工测序。再用 BamHⅠ和 XhoⅠ双
酶切 pGEM-T easy-vMIP-Ⅰ及 pEGFP-N3 质粒，回
收目的片段并与现行载体连接过夜，构建重组载
体 pEGFP-N3-vMIP-Ⅰ。经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶
切鉴定后将该质粒送至上海生工测序。
3.5 细胞培养
Jurkat 细胞复苏后，以含 10% FBS 的 RPMI-
1640 培养基在 37℃、5% CO2 及饱和湿度下培
养，收集连续培养三代后的细胞用于电穿孔。
3.6 电穿孔转染细胞
取对数生长期中期或末期且状态良好的 Jurkat 细
胞，1 000 r/min 离心 5 min 收集细胞，用无血清无抗生
素的 RPMI-1640 培养基重悬细胞至密度为每 100 μL
约 3×106~4×106 个细胞。分别以 20 μg 重组质粒
PEGFP-N3-vMIP-I 和 20 μg 空质粒 PEGFP-N3 作为实
验组和对照组与 100 μL 细胞悬液混合，各自转移至冰
浴的电穿孔杯中，在 150 V、22 ms 的条件下进行穿
孔。电穿孔后立即加入 500~900 μL 完全培养基，并将
电穿孔过的细胞转移到合适的培养器皿中(如 6 孔板)，
加入培养基维持细胞继续生长。
3.7 荧光显微镜观察和细胞收集
转染后的细胞培养 24 h 时，在荧光显微镜下
大致估计其转染效果，然后取样 200 μL 以流式细
胞仪精确测定其转染效率。转染后培养 36 h 时，
1 000 r/min 离心 5 min 收集细胞用于提取总 RNA。
3.8 转染后细胞总 RNA 提取与逆转录 PCR
按照细胞总 RNA 抽提试剂盒的说明进行操
作，核酸蛋白仪测定提取到的 RNA 纯度和浓度。
按照反转录试剂盒的说明进行 RNA 的逆转录，反
应条件为：Template RNA1.0 Ul (≤500 ng)，100 μmol/L
Random primers 0.5 μL ，Primerscript RT Enzyme
Mix 1 0.5 μL，5×Primerscript buffer 2.0 uL，50 μmol/L
Oligo dT Primer 0.5 μL， RNase Free water 5.5 μL，
置于 37℃ 15 min，85℃ 5 s。逆转录产物可长期保
存于-80℃。
3.9 实时定量 PCR 检测抗-HIV 相关基因的表达
以实验组和对照组总 CDNA 为模板，按照实时
定量试剂盒的说明进行，反应体积总共为 20 μL：
cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，50×ROX
Reference Dye 0.4 μL，10 μmol/L Forward Primer