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癌症与分子诊断研究
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
7
-
11
页
Aizheng Yu Fenzi Zhenduan Yanjiu (Online), 2012, Vol.1, 7
-
11
http://cmdr.5th.sophiapublisher.com
8
等
(1996)
研究认为
vMIP-
Ⅰ的瞬时表达能阻断
HIV
的感染。但
Boshoff
等
(1997)
人的研究进一步证实
vMIP-
Ⅰ通过阻断
HIV
与趋化因子受体
CCR3
、
CCR5
、
CXCR4
结合在抗
HIV
方面的作用不大。
Michael
等发现
vMIP-
Ⅰ可以通过宿主免疫应答来
调解
Th1/Th2
细胞的平衡，它主要能与趋化因子
受体
CCR8
结合发挥受体阻断效应，并指出
vMIP-
Ⅰ不能阻断由
CCR5
介导的
HIV
感染来发挥抗
HIV
的作用
(Lu et al., 2004)
。
vMIP-
Ⅰ抑制
HIV
感
染的作用机制尚无定论。
vMIP-
Ⅰ是否有可能通过
激活宿主抗
HIV-1
基因表达来抑制
HIV
感染值得
进一步深入研究。
本研究通过构建真核表达载体
pEGFP-N3-
vMIP-I
，电穿孔法将其转染至
Jurkat
细胞，荧光定
量
PCR
检测
vMIP-
Ⅰ基因对
Jurkat
细胞内
CCL5
、
APOBEC3G
、
APOBEC3F
等抗
HIV
基因表达水平
的影响，从而探讨
vMIP-
Ⅰ抗
HIV
感染的机制。
1
结果与分析
1.1
目的基因的
PCR
扩增以及
TA
克隆
以
Cosmid
Z6
为模板进行
PCR
扩增，以
2.5%
琼脂糖凝胶电泳检测
PCR
产物，结果显示在目的
基因片段大小位置出现了特异性的扩增
(
图
1)
。
Xho
Ⅰ和
Bam
H
Ⅰ双酶切，回收
vMIP-
Ⅰ基因全长
片段，并将其克隆在
pGEM-T easy
载体上，从而
构建出重组载体
pGEM-T easy-vMIP-
Ⅰ，经
Xho
Ⅰ
和
Bam
H
Ⅰ双酶切电泳鉴定后，出现与预期大小一
致的
vMIP-
Ⅰ基因片段
(
图
2)
。
图
1 vMIP-
Ⅰ片段
PCR
产物凝胶电泳图
注
: 1~2:
从
Cosmid
Z6
中
PCR
扩增出的
vMIP-
Ⅰ片段
; M:
DNAMarker 1
Figure 1 The gel electrophoresis diagram of vMIP-
Ⅰ
fragment
by PCR
Note: 1~2: Amplication of vMIP-
Ⅰ
fragment from
Cosmid
Z6;
M: DNAMarker 1
1.2
真核表达载体的双酶切鉴定
重组质粒
pEGFP-N3-vMIP-
Ⅰ经
Xho
Ⅰ
/
Bam
H
Ⅰ双
酶切后，
2.5%
琼脂糖凝胶跑电泳，可见与预期大小
一致的酶切片段
(
图
3)
。将该重组质粒送往上海生物
工程公司测序，结果显示所克隆的
vMIP-
Ⅰ基因序
列准确无误，无任何点突变，表明
pEGFP-N3-vMIP
Ⅰ真核表达质粒构建成功，可用于下一步的实验。
图
2 pGEM-T easy-vMIP-
Ⅰ双酶切鉴定
注
: 1~2:
Xho
Ⅰ和
Bam
H
Ⅰ双酶切鉴定重组质粒
pGEM-T
easy-vMIP-
Ⅰ
; M: DNAMarker 1
Figure 2 The restriction mapping of pGEM-T easy-vMIP-
Ⅰ
Note: 1~2: The identification of pGEM-T easy-vMIP-I by the
Xho
Ⅰ
/
Bam
H
Ⅰ
disgestion; M: DNAMarker 1
图
3
双酶切鉴定
pEGFP-N3-vMIP-
Ⅰ
注
:
Xho
Ⅰ和
Bam
H
Ⅰ双酶切鉴定重组质粒
pEGFP-N3-
vMIP-
Ⅰ
; M: DNAMarker 1
Figure 3 The restriction mapping of pEGFP-N3-vMIP-
Ⅰ
Note: 1~2: The identification of pEGFP-N3-vMIP-
Ⅰ
by the
Xho
Ⅰ
/
Bam
H
Ⅰ
disgestion; M: DNAMarker 1
1.3
转染后的
Jurkat
细胞荧光蛋白表达观察
重组质粒
pEGFP-N3-vMIP-
Ⅰ和阴性对照质粒
pEGFP-N3
转染
24 h
后在荧光显微镜下观察已有大
量的绿色荧光蛋白的表达
(
图
4)
，经流式细胞仪测定
其转染效率均达到
40%
左右，满足实验要求
(
图
5)
1.4
实时定量
PCR
检测抗
HIV
基因的表达
重组质粒
pEGFP-N3-vMIP-
Ⅰ转染
Jurkat
细胞
后使细胞内抗
HIV
相关基因的表达有不同程度的
上调，其中
CCL5
、
A3G
、
A3F
和
MX1
分别上调
7.37
倍、
1.58
倍、
2.42
倍和
2.06
倍，以
CCL5
的
表达上调水平最为明显
(
图
6)
。
2
讨论
早期流行病学研究发现并发卡波氏肉瘤的艾
滋病患者相对于并发其它疾病的存活时间更长
(Dawson and Hardy, 1989)
。后来相关研究表明，在
KSHV
感染的细胞中以及转染
KSHV
某些基因的
细胞中均发现一些
ARGs
表达的上调：
Ganem
的
研究小组发现
KSHV
裂解感染期使端粒酶永生化
的微血管内皮细胞
(telomerase-immortalized micro-
vascular endothelial, TIME)
中
ISG15
，
ISG20
等多条
ARGs
表达上调
(Chandriani and Ganem, 2007)
；
Yao
等
(2007)
人研究发现
KSHV
的
K15
基因使