医学检验检疫杂志
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
2
篇
,
第
7
-
14
页
Yixue Jianyan Jianyi Zazhi (Online), 2012, Vol.1, No.2, 7
-
14
11
图
5
诱导时间对
HA
抗原表位重组蛋白表达的影响
(1
mmol/L
IPTG)
注
: 1:
预染蛋白质
marker
Ⅲ
; 2:
pET
-
32
a(+)-HA
未诱导对照
;
3
~7:
分别为
pET
-
32
a(+)-HA
诱导
2
h, 4 h, 6 h, 8 h
和过夜
Figure 5 The affection of inducing time on the expression of
HA antigenicity recombinant protein (1 mmol/L IPTG)
Note: 1: Protein marker
Ⅲ
; 2:
pET
-
32
a(+)-HA non-induced control;
3
~7: pET
-
32
a(+)-HAinduced for 2 h, 4 h, 6 h, 8 h and overnight
图
6
HA
抗原表位重组蛋白
Western-Blot
试验
注
: 1:
预染蛋白质
marker
Ⅲ
; 2:
HA
抗原表位重组蛋白高免鸡血
清
; 3:
H5
亚型
AIV
标准阳性血清
; 4:
SPF
鸡阴性血清对照
Figure 6Western-Blot results for HAepitopes recombinant protein
Note: 1: Protein marker
Ⅲ
; 2:
Immuned chicken serum with HA
epitopes recombinant protein; 3: H5 subtype AIV positive serum;
4:
Specific pathogen free chick serum control
构建了
H5N1 AIV
的
HA
抗原表位基因表达质粒，
成功地对
H5N1 AIV
的
HA
抗原表位进行了表达，
在对表达产物的抗原活性进行了研究后，证明了
该基因表达产物具有良好的免疫原性和反应原
性，为下一步研究开发
H5N1 AIV
相关诊断和防治
技术奠定了基础。
大肠杆菌是基因工程技术中最常用的原核表
达宿主菌，其密码子偏好性影响着外源基因在其
中的表达丰度。经分析，本研究的
H5N1
亚型
AIV
HA ORF
基因中大肠杆菌稀有密码子分布密集，其
与外源蛋白表达密切相关的
CAI
、
FOP
及
CBI
指
数均远低于
1
，
序列中有些稀有密码子的使用频率
甚至≤
0.28%
。
稀有密码子距离的远近与外源基因
的表达有很大关系。距离越近，影响就越大。特
别是相邻并列的稀有密码子，如图
1
HA ORF
序列
中第
341
~343
位使用频率仅为
0.28%
的
3
个相邻并
列的稀有密码子
RRR
，
更是严重阻滞了
mRNA
信
息的传递，使蛋白翻译提前终止而最终影响目的
蛋白的表达丰度
(
图
4)
。
解决稀有密码子对外源基因
表达丰度的影响，目前常用的方法是对基因进行
突变。即利用同义密码子将原有的稀有密码子改
造成偏好性较高的、利于表达的常用密码子。这
种方法对于少量稀有密码子突变来说有一定意义
(
刘华雷等
, 2005;
李靖等
, 2006;
郑其升等
, 2006;
白
霞等
, 2008;
刘一尘等
, 2009)
。
但对大量稀有密码子
进行改造则难度较大，不但要耗费大量的人力、物
力，成倍增加成本，操作也十分繁琐复杂。
本研究在不改变原有基因信息的前提下，通
过生物信息学软件分析，选择了其中抗原表位集
中，稀有密码子之间距离相对较远的区域
(
如图
1
阴影部分
)
进行表达，结果得到了较理想的表达效
果
(
图
5)
。
通过对表达诱导剂
IPTG
的使用量和诱
导时间的测试，发现目的蛋白的表达量与表达时
间的有关，而与诱导剂的浓度无关。如图
5
所示，
HA
抗原表位重组表达质粒在
1
mmol/L IPTG
诱导
过夜后，在
48.1
kD
处出现了相对丰厚的表达产
物。说明外源基因氨基酸密码子组成是决定着外
源基因表达的关键，同时，表达时间长短也对外
源蛋白表达丰度有着重要影响。
图
6
Western-Blot
试验结果显示了
HA
抗原表
位重组表达蛋白不但能与
H5
亚型
AIV
标准阳性血
清起反应，出现特异性的杂交反应带。同时，利
用该蛋白作为抗原免疫
SPF
鸡，所采集的免疫鸡
血清也能与重组蛋白发生杂交反应，出现特异性
杂交带。这些结果说明该重组蛋白具有良好的反
应原性和免疫原性。由此可见，本研究在生物信
息学分析基础上所构建的
H5
亚型
AIV HA
抗原表
位基因表达质粒，在大肠杆菌
Rosetta-gami B (DE3)
菌株中所表达的重组蛋白保留了天然
HA
蛋白的抗
原活性，能作为
HA
蛋白的检测诊断试剂，在
H5
亚
型
AIV
的防治技术研究中有重要的实际应用价值。
3
材料与方法
3. 1
供试材料
H5N1
亚型
AIV HA
完整
ORF
基因重组质粒
pMD18
-
T-ORF
、
大肠杆菌
Rosetta-gami B (DE3)
、
原核表达载体
pET
-
32
a(+)
，
本实验室保存；质粒
DNA
抽提试剂盒
TIANprep Mini Plasmid Kit
，
购
自天根生化科技
(
北京
)
有限公司；
H5
亚型
AIV
阳
