医学检验检疫杂志
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
2
篇
,
第
7
-
14
页
Yixue Jianyan Jianyi Zazhi (Online), 2012, Vol.1, No.2, 7
-
14
12
性血清，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；辣
根过氧化物酶标记的羊抗鸡
IgG
抗体为
promaga
公
司产品；
6
×His-tagged protein
重组蛋白纯化试剂盒，
购自德国
GIAGEN
公司；限制性内切酶
Eco
R
Ⅰ、
Taq
DNA
聚合酶等
,
购自大连宝生物工程有限公
司；
CloneEZ
®
重组克隆试剂盒，购自南京金斯瑞
生物科技有限公司；
iBlot Gel Transfer Stacks
购自
invitrogen
公司；
MyCycler thermal cycler (Serial No.:
580
BR 5540) DNA
扩增仪，购自
Bio-RAD
公司。
3.2
基因分析及引物设计
根据
H5N1
亚型
AIV HA
基因序列
(
GenBank
登录号
:
GQ290463)
及本实验室保存的质粒
pMD18
-
T-ORF
基因测序结果，设计了一对扩增
HA ORF
全长基因的引物
P1
和
P2
。
同时，利用在线工具
、
gm.stanford.edu/WWW/www_predict.html
及
Anthe5.0
蛋白分析软件，对
H5N1
亚型
AIV HA
基因编码的
氨基酸、蛋白特性、在大肠杆菌中的偏好性及其
稀有密码子分布情况等进行分析，选择其中抗原
位点分布相对集中，亲水性较好，并且稀有密码
子分布相对有利于后期表达的区域，设计一对针
对抗原表位区域的特异性引物
P3
和
P4
。
引物由中
美泰和生物技术
(
北京
)
有限公司合成，用
dH
2
O
稀
释成
50
pmol/L
的工作浓度。引物信息具体见表
2
。
表
2
H5N1
亚型
AIV HA
基因扩增引物信息
Table 2 Primers for HA gene of H5N1 AIV
目的基因
Target gene
引物名称
Primer name
引物寡核苷酸序列
Sequence of oligonucleotide primer
扩增片段大小
Size of products
P1
ctgatatcggatccgtcatggagaaaatagtgcttc
HA ORF
HA ORF
P2
tgtcgacggagctcgtaaatacaaattct gcattgt
1 704
bp
P3
atatcggatccgaattcgagaaggccaatccag
HA
抗原表位
HA antigenicity
P4
tcgacggagctcgaattcctctctttgaggacta
732
bp
注
:
引物下划线部分与
pET
-
32
a(+)
载体多克隆位点
Eco
R
Ⅰ
两端序列一致
Note: The underline parts in oligonucleotide primers sequence are matched to both shoulders of the multicloning side of
Eco
R
Ⅰ
in
pET
-
32
a(+) vector
3.3
质粒
DNA
抽提
利用质粒
DNA
抽提试剂盒
TIANprep Mini
Plasmid Kit
，
按产品说明书提供的操作步骤对重组
质粒
DNA
进行抽提。质粒
DNA
样品置-
20
℃保存
备用。
3.4
目的基因扩增及电泳分析
目的基因扩增反应体系为
100
μL
，
其中：
25
mmol/L MgCl
2
10
μL
，
10
×PCR buffer 10 μL
，
2.5
mmol/L dNTPs 2 μL
，
5
units
Taq
DNA
聚合酶
1
μL
，
50
pmol/L
的上游引物和下游引物各
1
μL
，
DNA
模板
1
μL
，
用超纯水补足体积至
100
μL
。
DNA
扩增条件为：
94
℃
5
min
；
94
℃
30
s
，
50
℃
30
s
，
72
℃
1
s
，
35
个循环后，
72
℃延伸
5
min
。
扩增结束后，制备
1%
琼脂糖凝胶，取
10
μL
扩增
产物在
100
V
电压下进行电泳。电泳结束后，用
溴化乙锭对凝胶进行染色，最后在凝胶成像系统
上对扩增产物进行分析并拍照。
3.5
ORF
基因重组表达质粒的构建
以抽提的
pMD18
-
T-ORF
重组质粒
DNA
为模
板，按步骤
3.4
提供的方法，利用引物
P1
和
P2
对
HA ORF
基因进行扩增，并通过
1%
琼脂糖凝胶电
泳回收纯化
1 704
bp
的目的
PCR
产物。同时，用
Eco
R
Ⅰ
对
pET
-
32
a(+)
载体进行酶切并回收纯化酶
切产物。利用
CloneEZ
®
重组克隆试剂盒，将纯化
的
1 704
bp
的
PCR
产物与酶切后线性化的
pET
-
32
a(+)
载体连接，转化大肠杆菌
Rosetta-gami
B(DE3)
。
用引物
P1
和
P2
对插入的目的片段进行
PCR
扩增鉴定，并对阳性菌落的质粒
DNA
进行测
序，筛选含目的片段并插入方向正确的质粒，命
名为
pET
-
32
a(+)-ORF
。
阳性菌加
30%
终浓度的甘
油，-
20
℃保存备用。
3.6
HA
抗原表位基因扩增及重组表达质粒构建
以抽提的
pMD18
-
T-ORF
重组质粒
DNA
为模
板，按步骤
3.4
提供的方法，利用引物
P3
和
P4
对
HA
抗原表位基因进行
PCR
扩增。扩增结束后，
通过
1%
琼脂糖凝胶电泳回收纯化
732
bp
的目的
PCR
产物。同时，用
Eco
R
Ⅰ
对
pET
-
32
a(+)
载体进
行酶切，回收纯化酶切产物。利用
CloneEZ
®
重组
