医学检验检疫杂志
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
2
篇
,
第
7
-
14
页
Yixue Jianyan Jianyi Zazhi (Online), 2012, Vol.1, No.2, 7
-
14
9
表
1
HA
基因在大肠杆菌中表达的稀有密码子
(
临界值为
1%)
分析
Table 1 Analysis of rare codons translated in
E. coli
from HA gene (critical frequency: 1%)
基因
Gene
氨基酸序列大小
Size of amino
acid sequence
密码子总数
Codon number
使用频率≤
1%
的
稀有密码子数
Codon number with
frequency
≤
1%
使用频率≤
0.28%
的稀有密码子数
Codon number with
frequency
≤
0.28%
A
B
C
HAORF
567
567
156
23
0.175
0.377
-
0.090
HA
抗原表位
HA antigencity
244
244
70
9
0.177
0.374
-
0.098
注
:
大肠杆菌密码子使用频率越低
,
外源基因越难以表达
;
A:
密码子使用指数
(
CAI); B:
最佳密码子使用频率
(
FOP); C:
密码子
偏好性指数
(
CBI); A, B: CAI
和
FOP
取值均在
0
~1
之间
;
值越大
,
密码子偏好性越大
;
等于
1
时
,
密码子偏好性达最大
;
C:
密码
子偏好性随
CBI
值升高而增大
;
当
CBI
值等于
1
时
,
密码子偏好性达最大
;
当
CBI
值为负数时
,
表示最优密码子的使用次数少
于平均使用次数
Note: Codon frequency corresponds to the expression of exotic gene; Less frequency means that the exotic gene difficultly translated
in
Escherichia coli
;
A: Codon adaptation index (CAI); B: Frequency of optimal codons index (FOP); C: Codon bias index (CBI); A,
B: The range for the index of CAI and FOP is between 0~1; The increasing of CAI and FOP means that the codons tend to
Escherichia coli
bias; The codons would be adapted to the bias of
Escherichia coli
when the index reaches 1; C: The codon bias
increass followed by the index of CBI; The codon would be adapted to the bias of
Escherichia coli
when the index reaches 1; The
minus CBI means that the frequency of optical codon is less than the average
使用频率≤
1%
的一共有
70
个，使用频率≤
0.28%
的有
9
个，这些稀有密码子分布与
HA ORF
基因
密码子相比，相对有利于目的蛋白在大肠杆菌中
的表达。尤其是避开了第
341
~343
位置上的
3
个
使用频率仅为
0.28%
的稀有密码子
RRR
，
有效降
低了蛋白翻译提前终止的几率。
根据表
1
分析结果，本研究中的
HA ORF
氨
基酸密码子在大肠杆菌中表达的分别为
0.175
、
0.377
、-
0.090
；
HA
抗原表位基因在大肠杆菌中表
达的
CAI
、
FOP
、
CBI
值分别为
0.177
、
0.374
、
-
0.098
。
这些数值远低于大肠杆菌密码子的最佳偏
好性指数
1
，
说明大肠杆菌对这两个外源序列的密
码子偏好性均很低，属于较难表达的外源基因。
1.2
HA ORF
基因重组表达质粒的构建
对
pET
-
32
a(+)-ORF
重组表达质粒转化菌进行
PCR
鉴定，筛选能扩增出
1 704
bp
预期目的片段
的转化菌
(
结果见图
2)
，
转化菌的质粒
DNA
测序
结果经分析，与
pMD18
-
T-ORF
质粒中的
H5N1
AIV
的
HA ORF
序列一致，并与
NCBI (national
center for biotechnology information)
基因数据库中
的
H5N1 AIV HA
基因高度同源，结果见图
3
。
证
明目的片段已插入载体，成功构建了
HA ORF
基
因重组表达质粒。
1.3
HA
抗原表位扩增及重组表达质粒构建
引物
P3
和
P4
对重组质粒
pMD18
-
T-ORF DNA
扩增所得到的
732
bp
目的片段，经
1%
琼脂糖凝胶
电泳回收纯化后，与线性化的
pET
-
32
a(+)
载体连
接，构建重组表达质粒
pET
-
32
a(+)-HA
，
转化大肠
杆菌
Rosetta-gami B (DE3)
。
通过
PCR
扩增，筛选能
扩增出
732
bp
预期目的片段的转化菌
(
结果见图
2)
。
转化菌的质粒
DNA
测序结果表明，所插入的
732
bp
目的片段为质粒
pMD18
-
T-ORF
中的
HA ORF
基因
的抗原表位序列
(
结果见图
3
中阴影部分
)
。
证明成
功构建了
HA
抗原表位基因重组表达质粒。
1.4
重组质粒的诱导表达
分别含有重组表达质粒的
pET
-
32
a(+)-ORF
和
pET
-
32
a(+)-HA
的大肠杆菌
Rosetta-gami B(DE3)
菌
株，在不同浓度
IPTG
作用下诱导表达不同时间。
表达产物经
SDS-PAGE
电泳分析，结果发现，
IPTG
浓度及诱导时间对
HA ORF
目的蛋白的表达
量影响不明显。诱导表达菌体超声波沉淀物在约
85.4
kD (65 kD+20.4 kD)
处出现少量与预期目的一
致的表达产物堆积，而上清及未诱导对照在该位
置未发现有目的表达产物出现。同样，在
HA
抗原
图
2
重组表达质粒阳性菌落
PCR
扩增结果图
注
: 1:
HA
抗原表位
PCR
扩增产物
; 2: 100
bp DNA ladder
marker; 3: HA ORF
基因
PCR
扩增产物
Figure 2 Results for the amplification of the clone contained
recombinant expression vector
Note: 1: Amplified product for the HA epitopes; 2: 100 bp
DNA ladder marker; 3: Amplified product for HA ORF
