医学检验检疫杂志
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
2
篇
,
第
7
-
14
页
Yixue Jianyan Jianyi Zazhi (Online), 2012, Vol.1, No.2, 7
-
14
8
禽流感病毒
(
AIV)
是一种能引起禽类发生严重
急性传染病的
A
型流感病毒，其引起的禽流感被
国际兽疫局
(
OIE)
列为类
A
动物传染病。该病毒很
容易发生变异，至今已发现了
15
个血凝素
(
HA)
和
9
个神经氨酸酶
(
NA)
亚型。其中，
H5N1
是一种高
致病性亚型
AIV
，
能引起禽类大规模死亡并给养
禽业造成巨大的经济损失
(
Alexander, 1995; 2000)
。
有证据表明，
H5N1
亚型
AIV
还能通过多种途径传
播给人类及其它多种哺乳动物，如：猫、狗、猪、
虎等，导致其发病甚至死亡
(
Subbarao et al., 1998)
。
可见，
H5N1
除了对养禽生产具有严重危害外，对
人畜生命安全也有严重威胁，具有重要的公共卫生
意义
(
Class et al., 1998; Olsen et al., 2006)
。
AIV
基因组由
8
个独立的
RNA
组成，共编码
10
种蛋白。其中，
HA
蛋白是
AIV
的一个重要的
表面抗原性蛋白，在病毒的吸附和穿膜、决定病
毒致病力等方面起重要作用，也是病毒刺激机体
产生中和抗体的重要抗原
(
Suarez and Schultz-Cherry,
2000)
，
在疾病的诊断和防治技术的研究中有重要
意义。有关
AIV HA
蛋白的研究报道很多
(
Stephenson et al., 2004;
刘华雷等
, 2005;
李靖等
,
2006;
郑其升等
, 2006;
白霞等
, 2008;
刘一尘等
,
2009)
，
这些研究大部分是利用基因突变技术改造
稀有密码子来实现目的基因的表达。密码子是
mRNA
链上决定一个氨基酸的相邻三个碱基，与
基因遗传信息表达调控密切相关。外源基因
mRNA
密码子组成决定着外源基因在宿主中表达丰度。
密码子具有通用性，不同的生物密码子基本相
同，但不同物种在基因表达过程中对密码子的使
用却存在明显的偏好性。相关研究表明，密码子的
偏好性与宿主对外源基因的表达密切相关
(
Ikemura,
1985;
Kanaya et al., 1999; Archetti, 2004; Gustafsson
et al., 2004;
黄琦等
, 2008)
。
密码子使用指数
(
codon
adaptation index, CAI)
、
最佳密码子使用频率
(
frequency of optimal codons index, FOP)
、
密码子偏
好性指数
(
codon bias index, CBI)
是其中评定外源基因
表达的三个常用的密码子指数。
CAI
和
FOP
取值在
0
~1
之间，值越大，密码子偏好性越大；等于
1
时，
密码子偏好性达最大。而
CBI
取值≤
1
，
密码子偏
好性随
CBI
值升高而增大，当
CBI
值等于
1
时，
密码子偏好性达最大；当
CBI
值为负数时，表示
最优密码子的使用次数少于平均使用次数。此
外，序列中稀有密码子的分布距离对外源基因的
完整表达也有重要影响。本研究通过对
H5N1
亚型
AIV HA
基因的生物信息学进行分析后，选取一段
抗原表位相对集中、稀有密码子分布有利于表达
的区域，研究构建了
HA
抗原表位重组表达质粒
pET
-
32
a(+)-HA
，
实 现了 该 基因 在大 肠 杆菌
Rosetta-gami B(DE3)
中的高效表达。通过
Western-
Blot
验证了表达蛋白保留了
HA
蛋白的免疫原性和
反应原性，为下一步研究开发相关的诊断和防治
技术打下基础。
1
结果与分析
1.1
HA
完整
ORF
序列分析
H5N1
亚型
AIV
的
HA
完整
ORF
及抗原表位
氨基酸序列和密码子分析结果见图
1
和表
1
。
如图
1
所示，
ORF
基因编码的氨基酸序列全长为
567
aa
，
蛋白质等电点为
6.54
；
在
ORF
序列的共
567
个氨基
酸密码子中，使用频率≤
1%
的有
156
个，使用频
率≤
0.28%
的有
23
个，部分稀有密码子相距很近，
甚至相邻并列出现。尤其是在第
341
~343
位置并列
出现的
3
个使用频率仅为
0.28%
的稀有密码子
RRR
。
初步分析结果表明，
HA ORF
基因密码子组成本身
十分不利于该基因在大肠杆菌中的表达。图
1
阴影
部分为
HA
抗原表位序列，编码
244
aa
，
蛋白质等电
点为
8.29
。
该序列氨基酸密码子共
244
个，其中，
图
1
H5N1 AIV HA
基因编码的氨基酸序列在大肠杆菌中的
密码子使用情况表
(
临界值为
1%)
注
:
图中所示的全长序列为
H5N1 AIV HA ORF
基因编码的
氨基酸序列
,
其中阴影部分为本研究所设计的
HA
抗原表位
基因编码的氨基酸序列
;
序列中使用频率≤
1%
的大肠杆菌
稀有密码子用大写字母显示
;
使用频率≤
0.28%
的大肠杆菌
稀有密码子用带框的大写字母显示
Figure 1 codon frequency in H5N1 AIV HA amino acid sequence
translated in
Escherichia coli
(
critical frequency: 1%)
Note: The full length sequence is the amino acid sequence of
H5N1 AIV HA ORF; The amino acid sequence encoded by HA
epitope gene designed in this study is highlighted with shadow;
The codons translated in
E. coli
whose frequency is
≤
1%
are in
capital letters and those
≤
0.28%
are in capital letters with frame
