医学检验检疫杂志
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
2
篇
,
第
7
-
14
页
Yixue Jianyan Jianyi Zazhi (Online), 2012, Vol.1, No.2, 7
-
14
13
克隆试剂盒，将纯化的
732
bp PCR
扩增产物与酶
切后线性化的
pET
-
32
a(+)
载体连接，并将连接产
物转化大肠杆菌
Rosetta-gami B(DE3)
。
挑选形成
单菌落的转化菌，用引物
P3
和
P4
进行
PCR
扩
增，对能扩增出预期目的片段的转化菌质粒
DNA
进行测序，筛选含目的片段并插入方向正确的质
粒，命名为
pET
-
32
a(+)-HA
。
阳性菌加
30%
终浓
度的甘油，-
20
℃
保存备用。
3.7
重组蛋白的诱导表达
以
1%
的接种量分别将含有重组表达质粒的
pET
-
32
a(+)-ORF
和
pET
-
32
a(+)-HA
菌株接种到含
Cam (34 μg/mL)
、
Kan (15 μg/mL)
、
Tet (12.5 μg/mL)
及
Amp (50 μg/mL)
的
LB
液体培养基中，
37
℃
振荡
培养至生长对数期，当
OD600
读数在
0.4
~0.6
之间
时，加入不同浓度的
IPTG (
范围
: 1
~4 mmol/L)
进行
诱导表达，时间由
0
h
、
2
h
、
4
h
、
6
h
、
8
h
至过
夜。离心收获菌体，并用适量
PBS
重悬
,
同时加入
终浓度为
100
μg/mL
的溶菌酶，在冰上进行超声裂
解，并用
SDS-PAGE
电泳分别对裂解物上清液与
沉淀物进行检测。
3.8
HA
抗原表位重组表达蛋白纯化及高免血清制备
将含有重组表达质粒
pET
-
32
a(+)-HA
的菌株
接种到含相应浓度抗生素的
250
mL LB
培养基
中，按步骤
3.7
方法，加入终浓度为
1
mmol/L
的
IPTG
进行诱导表达过夜。收获菌体，用超声波裂
解后收集包涵体沉淀。利用
6
×His-tagged protein
重组蛋白包涵体纯化试剂盒对表达产物进行纯
化。以
200
μg
纯化蛋白与等量的福氏佐剂混合制
备成抗原，免疫
2
月龄
SPF
鸡，共
3
次。最后一
次免疫后
7
d
，
采血分离血清，-
20
℃备用。
3.9
Western-blot
试验
重组蛋白纯化后进行
SDS-PAGE
电泳
,
利用
iBlot Gel Transfer Stacks
转移试剂盒通过电转移将
蛋白转印到硝酸纤维素膜上，分别以
HA
抗原表位
重组蛋白
SPF
鸡高免血清、
H5
亚型
AIV
标准阳性
血清及未免疫
SPF
鸡血清为一抗，辣根过氧化物
酶标记的羊抗鸡
IgG
为二抗进行
Western-Blot
，
分
析重组蛋白的免疫原性及反应原性。
作者贡献
在庞耀珊为本研究的主要执行人，负责实验设计和大
部分实验内容的操作、数据整理及撰写论文；谢芝勋为本
论文的通讯作者，负责论文的修改和审核；谢丽基、邓显
文、谢志勤、刘加波和谢体三五位作者为本研究的各项实
验提供协助及建议。
致谢
感谢彭宜博士和范晴实习研究员对本研究的帮助；感
谢中美泰和生物技术
(
北京
)
有限公司的技术支持。
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