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基因组学与医学生物学(网络版), 2012 年, 第 1 卷, 第 3 篇, 第 18-22 页
Jiyinzuxue Yu Yixue Shengwuxue (Online), 2012, Vol.1, No.3, 18-22
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合成成本和连续反应的次数，寡聚核苷酸链的长度
应适宜，过长不利于合成、过短则增加成本和反应
次数。我们经过数次重复试验发现引物长度为
55~59 bp 时，在引物合成成本和扩增效率上的性价
比是最高的。其次是引物间重叠区域的长度和选
择，现有 SOE-PCR 技术中相邻引物间的重叠区域
一般为 25~30 个碱基，我们在实验中通过综合考虑
引物的 Tm 值和重叠区的碱基序列等因素，设计的
重叠区域短至 15~16 bp 均获得了有效的扩增。
(4)高质量的模板。由于每轮 PCR 产物作为下一
轮 PCR 反应的模板，所以 PCR 产物应进行纯化，以
免给后面的反应带来不良后果。同时在回收过程中尽
量避免 EB 及紫外对模板造成的损伤：如用于回收产
物的凝胶中应减少 EB 的加入量(低于 0.15 μg/mL)，
另外切胶过程中应尽量减少紫外线照射时间。
获得的融合基因经测序验证与预期完全一致，
在合成过程中没有产生突变。随后我们利用生物信
息学软件对融合基因推导的氨基酸序列进行了预
测和分析，结果表明HTPP-MDC为阳离子多肽、结
构稳定、具有亲水性，二级结构主要由α-螺旋、无
规则卷曲、延伸链和β-转角组成，与融合前亲本肽
的二级结构基本一致，在一定程度上说明融合多肽
保持了与天然多肽类似的空间构象。HTPP-MDC有
望开发成新型肝靶向抗HBV药物，成功构建融合多
肽并对其分子特征进行了预测和分析，为HTPP-
MDC的功能研究和开发利用提供了物质基础和理
论依据，同时也为应用SOE-PCR技术快速、准确地
构建融合基因提供有益借鉴。
3 材料与方法
3.1 实验材料
Escherichia coli (E. coli) DH5α、MDC/pMD20-T
质粒为本实验室保存。pMD20- T 载体，rTaq DNA
Polymerase，高保真酶 PrimeSTARHSDNAPolymerase，
DNA 分子量标准，限制性内切酶 KpnⅠ、Hind Ⅲ购
自 TaKaRa 公司；TIANpure Midi Plasmid Kit 和
TIANgel Midi Purification Kit 为北京 TIANGEN 公
司产品；其他化学试剂为国产或进口分析纯。
3.2 引物设计
设计 4 条寡核苷酸引物，其中 H1、M1 为与目
的基因同向部分的引物，H2、M2 为与目的基因互
补部分的引物，M1 和 M2 用于从 MDC/pMD 20-T
质粒中扩增 MDC 片段。H1 与 H2、H2 与 M1 之间
分别有 16 bp 的重叠互补区。外侧上游引物 H1 中
包含 KpnⅠ酶切位点，外侧下游引物 M2 中设计了
终止密码子和 Hind Ⅲ酶切位点，各引物在目的基
因中的位置如图 6 所示。引物设计如下 (划线部分为
酶切位点，斜体为重叠 DNA 序列部分，粗体为终
止密码子)：
H1: 5'-CGGGGTACCGACGACGACGACAAG
AATAGTCGTTCACTTG-3'；
H2: 5'-GTAATTTCTCGTTGTCTTCGTTATTTC
CATCATCATTTTCTCCAAGTGAACGACTATT-3'；
M1: 5'-GACAACGAGAAATTACGTGGATGGTTG
AAAAAAAT-3'；
M2: 5'-CCCAAGCTTATTAGTTACCCTTTAAT
GTGGCGGCA-3'；
3.3 SOE-PCR 法构建融合基因
将整条序列分成两段(HM1, HM2)，首先分别
PCR 扩增出这两段序列，然后用一轮 PCR 进行拼
接，最后扩增全长目的基因序列。
HM1 的扩增：将上述合成的引物 H1 和 H2 进
行链延伸反应，扩增体系如下：13.75 μL Sterile H 2O，
2.0 µL dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)，5.0 µL
5×PrimeSTAR Buffer，2.0 μL H1 Primer (10 μM/L)，
2.0 μL H2 Primer (10 μM/L)，0.25 µL PrimeSTAR
HS DNA Polymerase (2.5 units/μL) 。扩增条件为：
98℃ 10 s，68℃ 40 s，循环 30 次。
HM2 的扩增：以 pMD 20-T/MDC 质粒为模板，
M1 和 M2 为引物进行 PCR 反应，扩增体系如下：
14.75 μLSterile H2O，2.0 µLdNTPMixture (2.5 mmol/L
each)，5.0 µL 5×PrimeSTAR Buffer，1.0 μLM1 Primer
(10 μM/L)，1.0 μLM2 Primer (10 μM/L)，1.0 μL pMD
20-T/MDC Plasmid，0.25 µL PrimeSTAR HS DNA
Polymerase (2.5 units/μL)。扩增条件为：98℃ 10 s，
68℃ 40 s，循环 30 次。
全长目的基因的拼接与扩增：第一轮以上一步
PCR 扩增获得的 HM1 和 HM2 互为模板进行链延伸
反应，扩增体系如下：5.0 µL 5×PrimeSTAR Buffer ，
2.0 µL dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)，15.75 μL
Sterile H2O，1.0 μL HM1，1.0 μL HM2，0.25 µL
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 units/μL) 。
扩增条件为：98℃ 10 s，68℃ 30 s ，循环 10 次。第
二轮向 PCR 管内分别加入 1.0 μL 的外引物 H1 和
M2 大量扩增。扩增条件为：98℃ 10 s，68 ℃ 40 s，
循环 30 次。第三轮向 PCR 管内加入 0.125 μL 的 rTaq