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基因组学与医学生物学(网络版), 2012 年, 第 1 卷, 第 3 篇, 第 18-22 页
Jiyinzuxue Yu Yixue Shengwuxue (Online), 2012, Vol.1, No.3, 18-22
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SignalP 3.0 Server 分析 HTPP-MDC 的信号肽
分析图谱如图 4 所示。由分析结果可知，HTPP-MDC
中不存在信号肽序列，这与之前融合基因构建的设
想完全一致。
利用 PSORTⅡ Prediction 蛋白质亚细胞定位分
析软件对 HTPP-MDC 进行预测，结果显示其在各
细胞器分布比例为：细胞核 65.2%、细胞质 17.4%、
线粒体 17.4% ，这证实了 HTPP-MDC 编码蛋白属
于胞质蛋白。
用 NPS@对 HTPP-MDC 基因编码蛋白的二级
结构进行预测(图 5)，结果显示在 HTPP-MDC 氨基
酸序列中，α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和 β-转角各为
37、14、7 和2 处，分别占总二级结构的 61.67%、23.33%、
11.67%和 3.33%。由此可推测，HTPP-MDC 中主要结
构元件是 α-螺旋，其次为无规则卷曲和延伸链。
图 4 SignalP 3.0 Server 的神经网络(NN)分析 HTPP-MDC
Figure 4 Analysis of HTPP-MDC with neural networks (NN)
of SignalP 3.0 Server
图 5 HTPP-MDC 的 α-螺旋, β-转角, 延伸链和无规则卷曲的
位置分布
Figure 5 Distribution of α-helix, β-turn, extended strand and
random coil of NPS@ for HTPP-MDC
2 讨论
HBV 主要在肝细胞内寄生和复制，可导致急
慢性乙型肝炎发生，甚至引起肝硬化和肝癌，危
害极大。目前临床上用于 HBV 感染的抗病毒药物
虽具有一定疗效，但也存在着用药剂量大、疗效不
够理想、毒副作用大等问题。将可特异结合肝细胞
表面受体的 HTPP 与具有多重抗病毒机制的抗菌肽
融合，有望成为特异性好、用药量少、毒副作用小的
新型高效靶向抗 HBV 药物。本研究利用基因重组技
术构建融合基因，试图为获得一定量的 HTPP- MDC
进行后续的功能研究奠定基础。
目前融合基因的构建方法主要有限制内切酶
法和重叠延伸 PCR (gene splicing by overlap extension
PCR, SOE-PCR) 技术。SOE-PCR 技术简便易行，
不需要限制性内切酶消化和连接酶处理就可实现
任意两个目的基因的连接和扩增，克服了因设计限
制性内切酶位点而引入不必要的氨基酸残基的缺
点，保证了目的蛋白的真实性和完整性 (谷铁军等 ,
2010)。本研究对传统的 SOE-PCR 方法进行了改进，
通过三个反应步骤(图 6)成功地构建了融合基因。在
应用改进 SOE-PCR 技术快速、准确地进行基因融
合时，须注意以下几点：
(1) 在传统的 SOE-PCR 步骤中加入一步：即在
不加引物的情况下，将等摩尔的各片段混合先进行
10 个循环，这种方法可减少非特异性条带的产生，
提高产物的特异性。
图 6 HTPP-MDC 融合基因构建方法
Figure 6 Diagram of the construction of HTPP-MDC
(2)选择保真性能和扩增效率均高的 DNA 聚合
酶。应用普通的 DNA 聚合酶进行扩增时，PCR 产物
的 3 末端会产生 poly A 尾，将阻止互补区域退火以
后的延伸反应，并且容易造成移码、错配和突变等，
无法得到全长的融合产物，因此扩增过程中必须采
用具有 5′~3′聚合酶和 3′~5′外切酶的活性的高保真
聚合酶。但传统高保真聚合酶在扩增效率上，一直
难以令人满意，本研究使用的为 Prime-STAR HS DNA
Polymerase (TaKaRa 公司)，极大地提高了 SOE-PCR
反应的效率与准确性。本研究对现有 SOE-PCR 技
术的改进之处也在于考虑到下一步的 TA 克隆，直
接在最后一轮 PCR 反应液中加入普通 Taq 酶 72℃
延伸 20 min 为融合基因加上 Poly A 尾，不用再一次
进行 PCR 反应，同时也减少了突变的发生。
(3) 合理设计引物序列。首先应综合考虑碱基的