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基因组学与医学生物学
(
网络版
), 2012
年
,
第
1
卷
,
第
3
篇
,
第
18
-
22
页
Jiyinzuxue Yu Yixue Shengwuxue (Online), 2012, Vol.1, No.3, 18
-
22
http://gmb.5th.sophiapublisher.com
19
分子多肽，产生于生物免疫系统用于抵抗外界病原
体感染。研究显示
AMP
可通过阻断病毒粘附侵入
(Andersen et al., 2004)
，抑制病毒
DNA
复制
(Wachinger
et al., 1998)
，以及刺激机体免疫反应
(Jenssen, 2009)
等机制发挥抗病毒作用。
如能将肝靶向穿膜肽
(HTPP)
与抗菌肽
(AMP)
二者融合，构建的融合多肽将利用
HTPP
靶向肝脏，
进入肝细胞内直接发挥抗乙型肝炎病毒
(hepatitis B
virus, HBV)
作用，有望成为新型靶向抗
HBV
药物，对
降低
HBV
感染引起的发病率和死亡率具有重大意义。
本研究利用改进
SOE-PCR
技术构建
HTPP
与
来源于家蝇的抗菌肽天蚕素
(
Musca domestica
cecropin,
MDC)
融合基因，并用相关生物信息学方法对其推
导的氨基酸序列进行预测和分析，试图为融合基因
的基因工程表达及其生物活性研究奠定基础。
1
结果与分析
1.1
融合基因的构建和鉴定
利用
SOE-PCR
方法，以设计的
4
条引物进行扩
增得到片段
HM1
、
HM2
大小分别为
82 bp
、
154 bp
，
最后拼接的全长
HTPP-MDC
基因片段大小约为
220 bp
。结果显示每轮
PCR
产物的大小与预期相
符，无非特异性条带出现
(
图
1)
。
回收获得的全长目的片段并克隆入
pMD20
-
T
载体后，进行
PCR
和
Kpn
Ⅰ
/Hin
d
Ⅲ双酶切鉴定，结
果显示
PCR
扩增和酶切后的基因片段与预期片段大
小一致
(
图
2)
。测序结果表明该基因序列与预期完全
一致，没有突变发生。以上结果表明已成功构建
HTPP-MDC
融合基因。
图
1 HTPP-MDC
融合基因的
SOE-PCR
扩增
注
: M: DNA Marker; 1~3:
HM1
,
HM2
和
HTPP-MDC PCR
扩
增产物
Figure 1 SOE-PCR amplification of HTPP-MDC fusion gene
Note: M: DNA Marker; 1~3: PCR products of
HM1
,
HM2
and
HTPP-MDC
图
2
重组质粒
HTPP-MDC/pMD20
-
T PCR
及酶切鉴定
注
: M: DNA Marker; 1:
重组质粒的
PCR
鉴定
; 2:
重组质粒经
Kpn
Ⅰ
,
Hin
d
Ⅲ
双酶切
Figure 2 Identification of recombinant plasmid HTPP-MDC/
pMD20
-
T by PCR amplification and restriction enzyme digesting
Note: M: DNA Marker; 1: PCR identification of recombinant
plasmid; 2: recombinant plasmid digested by
Kpn
Ⅰ
and
Hin
d
Ⅲ
1.2
HTPP-MDC
的分子特征分析
ProtParam
分析结果显示
HTPP-MDC
基因编
码蛋白含
60
个氨基酸，其中碱性氨基酸
(Arg +Lys)
10
个，酸性氨基酸
(Asp+Glu) 8
个，含量最丰富的
氨基酸包括
Gly (11.7%)
、
Asn (10.0%)
、
Lys (10.0%)
；
其分子量为
6 516.2 Da
，理论等电点为
9.31
，分子
式为
C
274
H
459
N
91
O
93
；蛋白的脂溶性指数为
76.50
，
GRAVY
指数为-
0.985
，不稳定指数为
24.77
；在大
肠杆菌内的半衰期大于
10
小时，在体外有机体内的
半衰期为
3 min
，在体外哺乳动物网状细胞中的估
计半衰期为
1.4 h
。
用
ProtScale Server
进行亲水性
/
疏水性预测，
结果显示
HTPP-MDC
中亲水氨基酸数量大于疏水
氨基酸，且主要位于多肽链的
N
端
(
图
3)
。
图
3 HTPP-MDC
亲水性
/
疏水性预测结果
Figure 3 Hydrophilicity/Hydrophobicity prediction result of
ProtScale for HTPP-MDC