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基因组学与生物技术(网络版), 2012 年, 第 1 卷, 第 7 篇, 第 40-44 页
Jiyinzuxue Yu Shengwu Jishu (Online), 2012, Vol.1, No.7, 40-44
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大为缩短。
不同的 ICP 基因在同一菌株中的表达，由于都
集中在芽孢期，相互之间具有竞争性(Sanchis et al.,
1989)。因此我们可以假设，将两种杀虫蛋白基因一
个在营养期表达，另外一个在芽孢期表达，这样其
表达效果可能会比同时在芽孢期表达为好。进一步
推想，同一种 ICP 基因如果既能在营养期表达又能
在芽孢期表达，那么表达量也可能比只在营养期或
芽孢期表达的表达量要高很多。
3 材料与方法
3.1 菌株与质粒
本研究所用的菌株与质粒列于表 1。其中 Bt 菌
株 S3299-1 为携带 cry1Ac31 基因的野生菌株，由海
南省热带农业资源研究所分离；Bt 菌株 IPS 为无晶
体 Bt 突变株有英国 Univershity of Sussex 的 Neil
Crickmore 博士赠送。
3.2 培养基、抗生素与试剂
LB 液体培养基及固体培养基用于培养 Bt 和
E. coli；SOC 培养基用于电转化后的感受态细胞的
复苏。Bt 培养温度为 30℃，E. coli 培养温度为 37℃。
氨苄青霉素和四环素使用浓度分别 100 ug/mL 和
50 ug/mL。PCR 反应试剂购自大连宝生物工程有限
公司，PCR 引物由北京三博远志生物技术有限责任
公司合成。Pfu DNA 聚合酶及 T4DNA 聚合酶购自
上海生物工程有限公司。限制性内切酶及 T 4DNA
连接酶从 MBI 公司购买。Taq DNA 聚合酶由海南
省热带农业资源研究所提供。
3.3 cry3Aa 启动子 PCR 扩增及其产物回收
根据 cry3Aa 启动子设计一对引物 C3 -5/C3- 3，
序列为：C3 -5：5’-AGCTTAATTAAAGATAATATC
TTTGAA-3’; C3-3：5’- GGATTCATTTTTCTTCCTC
CCTTTCTT-3’。
以 Bt 菌株 Btt 总 DNA 作为模板，利用本研究
设计的引物 C3- 5/C3-3 和 Pfu DNA 聚合酶进行扩增
cry3Aa 启动子，扩增产物用琼脂糖凝胶 DNA 回收
试剂盒回收及纯化。PCR 反应条件参照 Song 等(1998)
的方法进行。
携带 pBUC3 的 E.coli 阳性克隆子的筛选也是使
用引物 C3 -5/C3- 3，以克隆子质粒 DNA 作为模板，
使用 Taq DNA 聚合酶扩增。携带 pBUC3-1 Ac31 的
IPS 阳性克隆子筛选以克隆子总 DNA 作为模板，分
别采用引物 C3-5/C3-3 和 K2-5/K2-3，使用 Taq DNA
聚合酶扩增。
3.4 Bt 营养期表达载体 pBUC3 的构建
用限制性内切酶 EcoRⅠ在 37℃水浴中完全消
化质粒 pBU4，用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，胶
回收、纯化后，利用 T4DNA 聚合酶补平粘性末端。
接着用等体积异丙醇置-20℃沉淀 10 min，12 000 r/min
离心 10 min 回收沉淀物，加入 10 μL TE 溶解。随
后，利用 T4DNA 连接酶将通过 PCR 获得的 cry3Aa
启动子片段和补平末端后的载体 pBU4 连接，转化
大肠杆菌 JM110 ，在含有氨苄青霉素(100 ug/mL)
和四环素(50 ug/mL)的 LB 培养基平板进行重组子
筛选，用 PCR (引物 C3-5/C3 -3)和酶切克隆子质粒
的方法鉴定阳性克隆，通过序列测定进一步确定启
动子序列是否正确插入 pBU4 质粒中。获得的表达
载体命名为 pBUC3。
3.5 cry1Ac31 基因在 IPS 中的表达
用限制性内切酶 BamHⅠ和 SalⅠ在 37℃水浴
中完全消化重组质粒 pCRY1Ac31 和载体 pBUC3，
消化产物用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收和纯化
后，利用 T4 连接酶将 cry1Ac 基因全长序列和表达载
表 1 本研究所用菌株与质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this research
名称
Name
特征
Characteristics
来源或文献
Sources or reference
E. coli JM110 Dcm, proAB, leu, dam, galK, thr, supE44 HITAR
B. thuringiensis S3299-1 Wild strain, Cry1Ac31, bidiamond crystal HITAR and Zhang et al., 2009
Bt subsp. tenebrions
B. thuringiensis IPS Bt mutant strain, non-crystal Dr Neil Crickmore
Bt IPSC3 -1 Transformed Bt IPS strain with Cry1Ac31 bidiamond crystal In this research
Bt IPS-pBU4 Transformed Bt IPS strain with pBU4 plasmid, non-crystal In this research
pBU4 Vector with multifunctional cloning site (5.7 kb), Ampr , Tcr HITAR
pBUC3 Vector derived from pBU4 adding Cry1Aa3 promotor (6.3 kb) In this research
pBUC3-1Ac31 pBUC3 containing cry1Ac31 coding sequence In this research
pQE1Ac31 pQE30xa carrying with cry1Ac31 gene from Bt S3299-1 HITAR and Zhao et al., 2009