分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1055-1061
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1055-1061
Copyright © 2016 BioPublisher 1059
收、连接、转化
(
感受态为农杆菌
GV31O1)
；测
序鉴定出阳性克隆。
VIGS
重 组 载 体 转 化 农 杆 菌
GV3101
：
pTRV-RNA1
、
pTRV-RNA2
、
pTRV-CLA1
、
pTRV-GhBES1
分别转化农杆菌
GV3101
。
VIGS
重组载体注射棉花叶片的步骤如下：倒
置培养
36~48 h
后，挑选单克隆与
7 mL LB
培养基
(LB+50 μg/mL
卡那霉素
+50 μg/mL
庆大霉素
)
，
28
℃、
200 r/min
过夜培养；将菌液接种于
50 mL
YEB
培养基
(YEB+20 μmol/L
乙酰丁香酮
+50
μg/mL
卡那霉素
+50 μg/mL
庆大霉素
+100 μmol/L
MES)
，
28
℃、
200 r/min
过夜培养，
OD600=1.5
；酶
标仪测量菌液
OD600=0.6
左右时，将菌液置于无菌
离心管，
4 000 r/min
，离心
8 min
，弃上清液，合并
几次沉淀的菌体于无菌烧杯中；用转化液
(YEB+200
μmol/L
乙酰丁香酮
+10 μmol/L MES+10 μmol/L
MgCl2)
悬浮菌体至
OD600=1.5
；将
pTRV-RNA1
分
别与
pTRV-RNA2
、
pTRV-CLA1
、
pTRV-GhBES1
的
悬浮液等体积混合，置于室温
3 h
；棉花幼苗子叶
平展，每株幼苗分别注射
2
片子叶，每片子叶注射
10 mL
左右，每组
30
株，
3
次重复。
3.3
生化指标的测定
3.3.1 Gh CLA1
和
GhBES1
基因沉默效率的检测
棉花幼苗注射完
10 d
左右，观察到
pTRV-CLA1
的处理苗出现白化现象，注射
35 d
后对空载对照
(pTRV-00)
和实验组
(pTRV- GhBES1)
棉花苗的第
2
片真叶，提取其总
RNA
，逆转录为
cDNA
，选用棉
花的
18s
为内参基因，
GhBES1
和
Gh18s
分别设计
荧光定量
PCR
的特异性引物已列出
(
表
1)
。
表
1
GhBES1
和内参基因
Gh18s
的引物序列
Table1
Primer sequences of
GhBES1
and reference genes
Gh18s
引物名称
The name of primer
引物序列
(5'-3')
Sequences of primer (5'-3')
Gh18s-F
CAACTTGCGTTCAAAGACTCG
ATGGTT
Gh18s-R
CAAGGAATCGAA
ACGAAAGAAGG
GhBES1-F
GGGGTACCATGACGTCAGGGA
CGAGAATGCC
GhBES1-R
GGAATTCCAGGAAAGGCGGG
TGAGCATG
实时荧光定量
PCR
参照带有
ROX
的
Platinum
SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (
美国
Invitrogen
公司
)
试剂盒说明书进行。
RT-PCR
反应参数为：
94
℃
15 s
；
94
℃
30 s
；
59
℃
30 s
；
72
℃
45 s
；
40 cycles
；
72
℃
2 min
。采用
ABI PRISM 7500
实时定量
PCR
仪
进行
RT-PCR
及检测，数据采用
2-ΔΔCt
法进行分析。
3.3.2
光和色素含量的测定
注射病毒后
35 d
后，用
2.5%
的
PEG6 000
干旱
胁迫
24 h
，分别取
pTRV-00
和
pTRV-GhBES1
棉花
幼苗的第二片真叶，测定其叶绿素
a/b
、总叶绿素
和类胡萝卜素含量，具体方法参照
(
木合热皮亚
,
艾
尔肯和张富春
, 2013)
。
3.3.3
含水量的测定
处理方法同上，采样后分别用相对含水量采用
烘干法
(
姚世响
, 2010)
对其相对水含量进行测定。
3.3.4
丙二醛
(MDA)
含量的测定
处理方法同上，采用硫代巴比妥酸比色法测定
MDA
含量
(
王瑜
, 2008)
；电导仪检测叶片的电导率
(
姚世响
, 2010)
。
3.3.5
渗透物质含量的测定
处理方法同上，采样后分别用酸性茚三酮显色
法测定
Pro
含量
(
姚世响
, 2010)
；蒽酮比色定测定可
溶性糖含量
(
姚世响
, 2010)
；雷氏盐法测定甜菜碱含
量
(
姚世响
, 2010)
。
3.4
统计分析
各个实验均为独立重复
3
次，实验数据的处理
与作图均为
GraphPad Prism 5
软件处理分析。
作者贡献
安汶铠负责实验的实施与论文的撰写。常丹和
杨艺参与了实验的设计与实施，张富春负责实验的
设计、指导与论文的修改。
致谢
本研究由国家自然科学基金
-
新疆联合基金重
点项目
(U1303282)
资助。
参考文献
Anjum S.A., Wang L.C., Farooq M., Hussain M., Xue
L.L., and Zou C.M., 2011, Brassinolide
application improves the drought tolerance in
maize through modulation of enzymatic
antioxidants and leaf gas exchange, Joumal
Agronomy and Crop Science, 197(3): 177-185
