分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1055-1061
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1055-1061
Copyright © 2016 BioPublisher 1058
椒
(Chung et al., 2004)
、矮牵牛
(Chen et al., 2004)
等，
王丽等人最新也报道了利用
VIGS
技术对棉花幼苗
GhCPS
基因的沉默
(Gao et al., 2011)
。本实验参照的
方法王丽等人的实验操作，用
VIGS
技术沉默
GhBES1
基因，对其基因的功能进行了初步摸索。
实验流程为将棉花幼苗注射含有
pTRV-GhBES1
的
重组载体
35 d
后，提取其总
RNA
后反转成
cDNA
，
做
Real time-PCR
检测
GhBES1
基因的表达量，仅
为空载
pTRV-00
的
21%
，表明
GhBES1
基因的沉默
体系
(VIGS)
建立成功，后续在
PEG6000
模拟干旱胁
迫下测定其生化指标来推测其基因的功能。
干旱胁迫下植物的生长发育变缓，其原因就是
植物体内水分缺失，造成了渗调物质增加、膜脂过
氧化损伤和离子毒害。
Anjum
等人的研究表明文冠
果苗在干旱胁迫下，油酸素内酯
(BR)
处理增加了文
冠果叶片的相对含水量、脯氨酸和可溶性糖含量
(Anju et al ., 2011)
。其
BR
信号通路中的
GhBES1
编码的
BES1
蛋白是植物防御的一种内源信号分
子，植物在受到干旱或盐胁迫情况下可以诱导该基
因的表达去抵御外界的胁迫
(Krishna, 2003)
。也有人
报道
GhBES1
编码的
BES1
蛋白
BR
信号通路是一
种重要的转录因子，去磷酸化的
BIN2
使得
BES1
蛋白去磷酸化后可以进入细胞核直接调控细胞内
相关抗旱的基因的表达
(He et al., 2005)
。这与我们
实验分析降低了棉花的抗旱性相一致，即沉默
GhBES1
使得棉花叶片的渗调物质游离脯氨酸和可
溶性糖的含量分别降低了
50.74%
和
39.51%
。进而
表明
GhBES1
基因很可能参与调控棉花抵御干旱相
关基因的表达。
干旱胁迫下可以导致活性氧破坏膜脂的过氧
化，其中丙二醛
(MDA)
是反映植物细胞膜损伤程度
的重要指标之一。聂石辉等人
(2011)
的研究表明干
旱胁迫不同程度的增加了大麦丙二醛的含量。我们
测得沉默
GhBES1
的棉花苗的
MDA
含量相对于空
载也显著增加，这一分析也进一步说明
GhBES1
基
因在植物抵御抗旱胁迫中的重要作用。本实验也研
究了沉默
GhBES1
基因对棉花的光合作用的影响，
结果显示，实验组与空载组相比较，叶绿素含量及
叶绿素光和效率
(
叶绿素
a/b)
变化不显著，这个分析
很可能表明
GhBES1
基因的表达与棉花的光合作用
系统无关。
随着
BR
可以提高植物抗旱性研究大量的报
道，进一步研究
BR
提高植物抗旱的调控机制显的
尤为重要。本研究利用
VIGS
技术沉默
GhBES1
基
因，分析显示沉默
GhBES1
基因的棉花苗相对于空
载的含水量、甜菜碱、脯氨酸、可溶性糖以及叶绿
素含量都有一定的降低，膜脂过氧化程度
(MDA
含
量
)
有一定的增加。表明
GhBES1
基因的表达很可能
与棉花的抗旱机制调控有关。也表明了
GhBES1
可
能是棉花的抗旱调节中发挥作用的一个基因。该结
果也为进一步的阐明
BR
信号通路提供了理论依据。
3
材料与方法
3.1
实验材料
3.1.1
沉默所用实验苗的处理
实验所用的棉花
„
新陆早
17
号
‟
种子由新疆农业
科学院经济作物研究玛纳斯试验站提供。挑选籽粒
饱满大小一致的棉花种子，用
70%
乙醇消毒
1 min
，
蒸馏水冲洗
3~4
次
,
用
15%
过氧化氢浸种
5 h
，蒸馏
水冲洗
3~4
次，播种到固体
MS
培养基中，进行无
菌培养，
10 d
后打开封口膜炼苗两天，然后将棉花
幼苗转至
Hoagland
营养液
(
木合热皮亚
,
艾尔肯和
张富春
, 2011)
中继续培养两到三天，以此时的棉花
幼苗为实验材料。
3.1.2
生理生化测定的棉花苗处理
注射完后计时，等到
10~15 d
时，注射
pTRV-CA
L1
棉花幼苗的
1~2
片真叶陆续出现漂白现象，最终统
计注射
pTRV-CAL1
的棉花幼苗白化率为
25/30=83.3
4%
，表明沉默成功。等到
35 d
时，用
2.5%
的
PE
G6000
模拟干旱胁迫处理
24 h
后，分别采样，放
置于
-80
℃冰箱，以备后续试验。
3.2 VIGS
重组载体的构建与注射棉花
用于建立
VIGS
体系的
pTRV (pTRV-RNA1
和
pTRV-RNA2)
载体与携带
CAL1
基因的病毒载体由
中国农业大学馈赠。植物的
CLA1 (
Cloroplastos
alterados
1, CLA1)
编码
1-
脱氧木酮糖
-5-
磷酸合成
酶
(1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase)
，参与叶绿
体的发育过程，且此酶在进化中高度保守，棉花中
此基因沉默后植株叶片表现出光漂白症状
(Gao et
al., 2011)
，本实验以此基因作为
VIGS
体系操作成
功与否的评价。
VIGS
重组载体的构建：根据
GHBES1
干涉
位点分析结果设计特异性引物，以
CDNA
为模
板进行
RT-PCR
扩增，扩增产物和
PTRV-RNA2
载体分别进行双酶切
(
Kpn
Ⅰ和
Xba
Ⅰ
)
后，进行回
