分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1055-1061
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1055-1061
Copyright © 2016 BioPublisher 1056
到不利影响
(
陈丽萍和何道一
, 2010)
。因此研究棉花
的抗旱机制，提高棉花的抗旱性，对于新疆棉花产
业的发展有重要的意义。
油酸素内酯
(Brassinosteroid, BR)
是最新发现一
种与植物的发育和抗逆相关的植物激素。已有研究
表明
BR
可以降低植物在非生物胁迫如干旱
(
阮英慧
等
, 2011)
、高盐
(
刘金隆
, 2013)
和高温
(
曹云英和赵
华
, 2007)
等条件的损伤。在
BR
信号通路中，
GhBES1
编码的
BES1
蛋白是一种重要的转录因子，去磷酸
化的
BIN2
使得
BES1
蛋白去磷酸化后可以进入细
胞核直接调控细胞内相关抗旱的基因的表达
(He et
al, 2005)
。因此分析
GhBES1
基因的功能显得尤为
重要，本研究采用病毒有诱导的基因沉默技术对
GhBES1
基因的功能进行了初步的研究。
病 毒诱 导的 基因 沉默
(
Virus-induced gene
silencing
, VIGS)
是最近几年发现的转录后水平上的
一种基因沉默技术，它是指将带有一段靶基因的重
组病毒载体转入根瘤农杆菌
(GV3101)
侵染植物，引
起植物体内同源基因的沉默或表型变异，进而通过
生理指标测定指标和表型变异来分析该基因的功
能
(Burch-Smith et al, 2004)
。该技术与传统的转基因
技术相比较有周期短和高效实用等优点
(
王丽等
,
2014)
。当前已有用于棉花赤霉素合成酶基因功能验
证的报道
(Gao et al., 2011)
。本实验通过
VIGS
技术
沉默棉花
„
新陆早
17
号
‟
幼苗的
GhBES1
基因，研究
PEG6000
模拟干旱胁迫下的渗调物质、
MDA
、含
水量以及叶绿素含量的变化，为进一步验证
GhBES1
的功能提供理论依据。
1
结果与分析
1.1
重组载体
pTRV-GhBES1
的构建
根据沉默干涉位点分析得到棉花
GhBES1
基因
的干涉片段为
650 bp
，以棉花
„
新陆早
17
号
‟
叶片所
提取的
cDNA
为模板，由设计特异性引物扩增后进
行琼脂糖凝胶电泳
(
图
1A)
，在
650 bp
左右出现，扩
增产物和
pTRV-RNA2
载体分别进行双酶切
(
Kpn
Ⅰ
和
Xba
Ⅰ
)
后，进行回收、连接、转化
(
感受态为农
杆菌
GV31O1) (
图
1B)
；测序鉴定出阳性克隆。
1.2 GhCLA1
和
GhBES1
基因沉默效率的检测
相对于空载
pTRV-00
，
pTRV-GhBES1
植株的
GhBES1
的表达量只有
pTRV-00
植株的
21% (
图
2)
，由
此表明棉花苗的
GhBES1
基因沉默成功。在
PEG6000
模拟干旱胁迫条件下，
pTRV-00
和
pTRV-GhBES1
植株
图
1 pTRV-GhBES1
的扩增和酶切鉴定
注
: M: DL 2000 Marker; A: 1~2: pTRV-GhBES1
的扩增；
B: 1:
pTRV-GhBES1
重组质粒的
Kpn
Ⅰ和
EcoR
Ⅰ双酶切鉴定
Figure 1 The amplification and digestion identification of
pTRV-GhBES1
Note: M: DL 2000 Marker; A: 1~2: The amplification of
pTRV-GhBES1; B: 1: Identification of recombined plasmid
pTRV-GhBES1 digested by
Kpn
Ⅰ
and
EcoR
Ⅰ
的基因表达量分别是相对于非干旱胁迫下基因表达量
的
2.41
和
3.4
倍。表明干旱胁迫下促进
GhBES1
的表达。
图
2
沉默
GhBES1
对棉花叶中
GhBES1
的表达影响
Figure 2 Effect of silenced GhBES1 on expression of GhBES1
in the cotton
1.3 GhBES1
基因沉默后植株含水量的检测
干旱胁迫
24 h
后，测量植株含水量
(
图
3A)
，相
对于空载
pTRV-00
，
pTRV-GhBES1
植株的含水降低
了
5.4%
，但无明显差异。
测量可溶性糖含量可知
(
图
3B)
，
pTRV-00
植株
和
pTRV-GhBES1
植株可溶性糖含量有显著性差异
(P=0.0221)
。相对于
pTRV-00
植株，
pTRV-GhBES1
植株可溶性糖含量下降了
39.51%
。
1.4 GhBES1
基因沉默后光和色素含量的测定
干旱胁迫
24 h
后，分别对空载
pTRV-00
和
pTRV-GhBES1
植株的叶绿素
a
、
b
、叶绿素
a/b
和类
胡萝卜素进行了测量，与空载
pTRV-00
组相比，实
验组的叶绿素
a
、
b
和类胡萝卜素含量分别降低了
7.1%
、
15.6%
和
14.4%
。而叶绿素
a/b
相反增加了
12.01% (
图
4)
。但与空载相比都没有显著性差异。
