MPB -2016v14n4 - page 7

分子植物育种(网络版), 2016 年, 第 14 卷, 第 1024- 1028 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1024- 1028
http://biopublisher.cn/index.php/mpb
Copyright © 2016 BioPublisher 1027
GCAGTCGACGGTACCCGTTACATAACTTACG
GTAAATGGCCCGCCTGGCTAACTAGAGATCT
AGAGCGAC-3’。
3.4.3 重组克隆载体 pUC19-AG 的构建
(1)插入片段制备。将 AG 敲除序列正负义链
(100 μmol/L)等比例混合后，加热到 95℃，3 min，
自然冷却至 40℃以下，得到所需双链 DNA；
(2)正负义链连接反应，连接体系(表 1)。将双
链 DNA 与酶切纯化后的 pP1C.2 载体片段连接、
转化大肠杆菌，构建得到重组 pP1C.2-AG 载体；
(3)测序。对重组载体进行测序，确认插入序
列的正确性。
表 1 连接反应体系
Table 1 Ligation reaction system
试剂
Reagent
用量(μL)
Amount (μL)
pUC19- AG 20
插入片段 1
ddH2O
Total
9
30
3.4.4 回收目的片段
利用 EcoR I、Nhe I 双酶切重组载体 pUC19-
AG，DNA 回收试剂回收约 520bp 的 DNA 片段。
酶切反应：用 EcoR I 和 Nhe I 限制性内切酶
对 pUC19- AG 重组载体双酶切，置于 37℃进行双
酶切反应 3 h，然后置于常温下反应过夜，充分酶
切，回收。酶切反应体系(表 2)如下：
表 2 EcoRI 和 NheI 双酶切反应
Table 2 Double enzyme digestion reaction of EcoRI and NheI
试剂
Reagent
用量(μL)
Amount (μL)
pUC19-AG 20
EcoR I 1
Nhe I 1
10×Buffer 3
ddH2O 5
Total 30
3.4.5 重组表达载体 pCAMBIA1302- AG 载体
的构建
(1)线性化表达载体 pCAMBIA1302-Cas9。用
EcoR I 和 Xba I 先后分别酶切 pCAMBIA1302
-Cas9，回收线性化片段。
酶切反应：用 EcoR I 先对 pCAMBIA1302
-Cas9 载体酶切，置于 37℃进行双酶切反应 3 h，
然后置于常温下反应过夜，充分酶切，回收线性
化载体。Nhe I 酶切回收的线性化载体，置于 37℃
进行双酶切反应 3 h，然后置于常温下反应过夜，
充分酶切，回收连接反应需要的线性化片段。连
接体系(表 3)。
表 3 酶切目的片段反应体系
Table 3 Enzyme reaction system of the objective gene fragment
试剂
Reagent
用量(μL)
Amount (μL)
Plasmid
EcoR I 或 Xba I
20
1
10×Buffer 3
ddH2O 6
Total 30
(2)胶回收的 520 bp DNA 片段与酶切后的 p
-CAMBIA1302-Cas9 利用 T4 DNA 酶进行连接，
构建表达载体 pCAMBIA1302-AG。
连接反应：连接体系(表 4)，将反应体系置于
16℃反应一周，大片段充分链接。转化大肠杆菌，
筛选阳性克隆菌落。
表 4 表达载体连接反应体系
Table 4 Ligation reaction system for the construction of
transgenic vector
试剂
Reagent
用量
Amount
pCAMBIA1302-Cas9 1 μg
520 bp DNA fragment 1 μg
10×Buffer 5 μL
T4 DNA ligase 2 μL
Total 50 μL
3.4.6 转化与重组载体(pCAMBIA1302-AG)的筛选
取 2~4 µL 连接产物转化 E.coli DH5α 感受态
细胞。热激法转化大肠杆菌与单克隆筛选：用 PCR
及质粒 DNA 双酶切鉴定后，提取质粒 DNA，备
用。碱法小量提取质粒 DNA
3.5 农杆菌转化
采用冻融法转化农杆菌，并进行菌落 PCR 验
证，然后保存菌液，取 700 mL 菌液和 300 mL 甘
油混于 1.5 mL 的 Eppendorf 管中，于-20℃保存，
用于后续拟南芥的遗传转化实验。
作者贡献
王晓霞是本研究的实验设计和实验研究的
执行人；苏哲、岳彩云完成数据分析，负责论文