分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1024
-
1028
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1024
-
1028
Copyright © 2016 BioPublisher 1026
图
2
菌落
PCR
筛选
注
: M: DL2000 maker; 1: pUC19-AG; 2: pCAMBIA1302-
AG
Figure 2 Colony PCR screen
Note: M: DL2000 maker; 1: pUC19-AG; 2: pCAMBIA1302-
AG
图
3
pUC19-AG
酶切电泳图
Figure 3 Enzyme electrophoresis map of pUC19-AG
拟南芥作为模式植物，在分子研究领域有着
植株小、结实多、生命周期短、基因组简单、遗
传操作简便等优势，拟南芥基因组测序的完成使
得大量涉及重要生命过程的基因被发现，对于开
展遗传分析、基因克隆和功能研究意义重大。
3
材料与方法
3.1
植物材料
试验采用在实验室中培养室进行培养的拟南
芥无菌苗。
3.2
菌株与质粒
CRISPR-Cas9
植物基因敲除系统包含克隆载
体
pUC19-U3
和表达载体
pCAMBIA1302-Cas9
；
本实验所用的大肠杆菌
(
E.coli
)
菌株为
E.coli
DH5α
，农杆菌菌株为
GV3101
。
3.3
酶和生化试剂
Taq
酶、
T4 DNA
连接酶、
Bbs
I
酶、
EcoR
I
酶、
Nhe
I
酶、
DNAMaker DL 2000
等试剂及
DNA
纯化回收试剂盒等。
3.3
愈伤组织诱导
无菌环境下，切取实验室的无菌苗叶片，接种
到
1/2 MS
基本培养基培养，附加激素
2,4-D
和
6-BA
进行处理：
2,4-D
的浓度设
0
、
0.2 mg/L
、
0.5 mg/L
、
1.0 mg/L
和
2.0 mg/L 5
个梯度，
6-BA
的浓度为
0.5 mg/L
。每种培养基接种
50
个样，约
21
天后
观察叶片愈伤形态，统计愈伤组织的诱导率。
3.4
表达载体构建
3.4.1
AG
基因敲除靶位引物序列设计
(1)
在
AG
基因序列中设计一对
20 bp
的
oligo
DNA
片段：
5’-3’
：
ATCGTCTTCTCTAGCCGTGG
在基因的起始密码子
ATG
后，找到
Cas9
的
识别位点
PAM
结构，找到
PAM
结构
AGG(
下划
线标出
)
，在
PAM
结构前找
20 bp
序列片段设定为
靶位序列：
ATCGTCTTCTCTAGCCGTGG
。
5’- GTCGCACTC
ATCGTCTTCTCTAGCCG
PAM
靶位点
TGG
TCGTCTCTATG…3’
SgRNA-3’-UAGCAGAAGAGAUCGGC-5’
(2)
设计敲除靶位序列：正义链
AG
-P
：
5’-GCA-
AATCGTCTTCTCTAGCCGTGG-3’
；反义链
AG
-D:
5’-AAACCCACGGCTAGAGAAGACGAT-3’
。其
中
GCAA
和
CAAA
分别为上游和下游
BbsI
酶切
形成的粘性末端，以连接线性化的
pUC19-U3
。引
物由上海生工合成，纯化级别为
PAGE
。
3.4.2
构建克隆载体
pUC19-
AG
(1)
线性化克隆载体
pUC19-U3
。使用限制性
内切酶
Bbs
I
酶切克隆载体
pUC19-U3
载体，并利
用
DNA
片段纯化试剂盒过滤除去
22 bp
片段，回
收
3.2 kb
的线性化片段；
pUC19-U3
部分序列
(
标注下划线序列为酶切
除序列
)
：
5’-CATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGC
AGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACG
ACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGG
CTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGA
GTTGTGGATGATCCGTGGCAAgggtcttcgagaagac
ctGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAAT
AAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTG
GCACCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGGTT-
TGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGG
ACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCT
