分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1087-1094
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1087-1094
Copyright © 2016 BioPublisher 1091
的干扰。
Hsp17.6I
在独行菜种子解除低温萌发停滞
的过程中，表达量增加，提高了其耐冷性。
过氧化物酶
(POD)
是植物细胞内的保护酶，不
仅与植物抵御低温等不良环境有关，还在一定温度
范围内，随温度升高，活性增加
(
刘应迪等
, 2001)
。
Per12
和
Per28
都是典型的氧化还原酶
Ш
家族成员
(Tognolli et al., 2002)
，属于跨膜蛋白，主要存在于
液泡中，在种子发育早期受环境诱导表达，它有许
多酶辅助因子结合位点，如血红素
b
和
Ca
2+
结合位
点
(Theologis et al., 2000; Dunand et al., 2002)
。当植
物组织受到外界环境压力如创伤，病原体侵害和氧
化应激时，可以依赖各同工酶亚型清除
H
2
O
2
，有毒
还原剂，合成和降解木质素，木栓，分解代谢生长
素等
(Schenk et al., 2000)
。短时间较高温度刺激低
温层积的独行菜种子，种子内过氧化物酶含量增
加，利于
H
2
O
2
的清除，提高其耐受低温的能力。
然而，在种子萌发初期，通过抑制某些过氧化物酶
基 因 的 表 达 量 ， 如 抗 坏 血 酸 过 氧 化 物 酶
(APX)(Sung et al., 2005)
，可以使种子内的
H
2
O
2
得
到积累，从而刺激种子的萌发，提高萌发率。故而，
独行菜种子低温萌发停滞解除过程中，过氧化物的
增加虽保护了独行菜免受低温伤害，但不是促进其
萌发的关键基因。
细胞分裂控制蛋白
E(Cdc48E)
属于
AAAA-
TPase
家族，亚细胞定位主要在细胞核中，随着细
胞分裂过程中新细胞壁的形成定位于成膜体中，通
过与相同的细胞器发生同型膜融合从而在细胞分
裂和生长过程中起作用
(Tabata et al., 2000; Seki et
al., 2002)
。
Cdc48E
通常包含
809
个氨基酸，在拟南
芥的芽等生长旺盛的细胞中高度表达
,
参与新细胞
壁的形成和核膜的解体与重建
(Yamada et al., 2003;
Saracco et al., 2009)
。
25
℃处理低温层积
10 d
的独
行菜种子
1 h
后，
Cdc48E
蛋白含量显著增加，促进
细胞周期进行，有利于胚细胞进一步的生长和发
育。
本研究分别从蛋白水平和转录水平对独行菜
种子低温萌发不同时期的基因表达情况进行了分
析和讨论。结果表明：细胞分裂控制蛋白
E
基因
(CDC48E)
，过氧化物酶
12
基因
(PER12)
和小分子量
热激蛋白基因
(HSP17.6)
在低温层积的独行菜种子
经
25
℃处理一段时间后，显著上调表达，这与蛋白
表达结果一致。
25
℃处理时间的长短影响萌发停滞
期的独行菜种子的萌发率，且萌发率随处理时间的
增长明显提高。这一表型变化结果也佐证了
25
℃短
时间处理低温层积的独行菜种子，会影响某些基因
的表达，而这些基因的表达产物对独行菜耐受低温
萌发起到有利作用。低温是影响作物产量的关键逆
境因子之一，研究影响独行菜种子低温萌发的关键
因子，可以帮助了解植物低温萌发的分子机制，最
终为改良作物的遗传形状提供依据。
3
材料与方法
3.1
材料及处理
独行菜种子采集于新疆乌鲁木齐市鲤鱼山，选
择成熟饱满的种子，室温干燥保存。
通过对不同温度打破低温抑制的效果进行比
较，确定
25
℃的效果最好
(
赵惠新等
, 2010)
。种子处
理分为三组：第一组是低温层积前的种子，即直接
用无菌水湿润的种子；第二组是低温萌发停滞状态
的种子，即湿润后的种子置于
4
℃层积
10 d
；第三
组是解除低温萌发停滞的种子，即层积后的种子置
于
25
℃处理
50 min
。种子样品液氮条件下研磨成粉
末，置于
-80
℃冰箱备用。
3.2
蛋白质样品的制备及蛋白含量测定
采用
TCA/
丙酮沉淀法
(Agnieszka and Juan,
2013; Vasconcelos et al., 2005; Wu et al., 2014)
分别
提取一、二、三组种子的总蛋白。采用
Bradford
法
(1976)
测定总蛋白的浓度，计算各样品蛋白含量。
3.3
独行菜种子萌发低温相关响应蛋白的筛选
采用双向电泳技术分别对三组蛋白质进行分
离。其中等电聚焦选用
17 cm
线性
IPG
预制胶条
(pH3-10)
，上样量按照种子质量统一进行定量上
样，具体方法参照野生小麦
(Gharechahi et al., 2014)
和春大豆
(Tian et al., 2015 )
蛋白的双向电泳过程，略
作改动。与第一、第二组进行比较，从第三组种子
(
解除低温萌发停滞的种子
)
样品中筛选差异表达的
蛋白。运用
PDQuest8.0
软件分析
2-DE
图谱，筛选
表达量变化超过
3
倍的蛋白质点，并采用
LC/MS-MS
进行质谱鉴定。
3.4
独行菜种子萌发低温相关响应蛋白的表达量与
低温萌发关系的分析
比较筛选获得的几种与低温萌发响应相关蛋
白在第一、第二组、第三组种子中表达情况；将处
于低温萌发停滞期的种子分成
5
份，分别用
25
℃
诱导处理
0
、
30 min
、
45 min
、
50 min
、
55 min
、
1 h
，
