分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1080-1086
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1080-1086
Copyright © 2016 BioPublisher 1084
3
材料和方法
3.1
菌株
炭样小单孢菌
JXNU-1(
M. carbonacea
JXNU-1)
由江西师范大学生命科学学院提供；嗜根考克氏菌
(
K. rhizophila
)
由江西师范大学生命科学学院提供。
3.2
培养基和主要试剂
NB
肉汤培养基购自杭州微生物试剂有限公
司，高氏Ⅰ号培养基制备参见文献
(
李瑾等
, 2013)
，
种子培养基和发酵培养基制备参见文献
(
李瑾等
,
2013)
。
iTRAQ8
标记试剂盒与
Triethylammonium
bicarbonate buffer (TEAB)
购自
ABI
公司；胰蛋白酶
(Trypsin)
购自
sigma
公司；
2-D Quant Kit
购自
GE
Healthcare
公司。
3.3
炭样小单孢菌的发酵培养与抗生素溶液的制备
参照文献
(
龙中儿等
, 2008b)
的方法进行：将发
酵液
4 000 r/min
离心
20 min
，去沉淀，上清用新华
滤纸过滤，用量筒量取滤液后，加入两倍体积的无
水乙醇，在
4
℃冰箱沉淀
4 h
，然后
4 000 r/min
离心
15 min
，把上清
pH
调成
7.0
，用旋转蒸发仪除去酒
精，加蒸馏水恢复原发酵液的体积，测浓度为
117.5
ug/mL
，用针孔式过滤器过滤除菌，并验证过滤除
菌的方法有效，
4
℃冰箱保存备用。
3.4
抗生素对嗜根考克氏菌及其细胞壁合成的影响
测定抗生素
JX
对细菌细胞壁含量的影响
(
彭伟
梦
, 2010)
：配制含不同浓度抗生素
JX
的
NB
培养基
50 mL
，接入嗜根考克氏菌菌悬液，使嗜根考克氏
菌的终浓度为
105 cfu/mL
，
200 r/min
、
37
℃振荡培
养
12 h
，显微观察抗生素
JX
作用下的嗜根考克氏
菌体形态，发酵液
4 000 r/min
离心
20 min
，倒掉
上清，离心管壁上残留的水分用吸水纸吸干，称取
相同质量的湿菌体，并向管中加入相同体积的蒸馏
水，重悬后，超声破壁
(
间歇
5 s,
工作
3 s,
共
20 min)
，
4 000 r/min
离心
20 min
，收集上清液，
10 000 ×g
离
心
20 min
，倒掉上清，收集沉淀即细胞壁碎片，比
较抗生素作用下细菌细胞壁含量的变化。每试验重
复三次，取其平均值。
3.5
抗生素对嗜根考克氏菌蛋白质表达的影响
3.5.1
样品的处理
配制含不同浓度抗生素
JX
的
NB
肉汤培养基
50 mL
，设不加抗生素
JX
的
NB
肉汤培养基为对照
组，分别接入嗜根考克氏菌菌悬液，使嗜根考克氏
菌的终浓度为
105 cfu/mL
，
200 r/min
、
37 °C
培养
12 h
。将培养物置于
4 000 r/min
离心
20 min
，弃上
清，
PBS
洗涤
3
次，收集菌体样品。
3.5.2
蛋白质的提取
蛋白质的提取
(
马良宏等
, 2015)
：分别称取相同
质量的菌体样品，然后用蛋白裂解液溶解，之后分
别加入终浓度为
2 mm
的
EDTA
，
1 mm
的
PMSF
，
5 min
后，加
DTT
至终浓度为
10 mm
，超声破碎
15
min
后，
25 000 g
下离心
20 min
，取上清液，然后
加
5
倍体积预冷过的丙酮，于
-20
℃静置
2 h
，再用
16 000 g
离心
20 min
，倒掉上清液，收集沉淀，添
加一定量的蛋白裂解液溶解，之后分别加入终浓度
为
2 mm
的
EDTA
，
1 mm
的
PMSF
，
5 min
后，加
DTT
至终浓度为
10 mm
，超声破碎
15 min
后，
25 000
g
下离心
20 min
，取上清液，添加
DTT
至终浓度为
10 mm
，
56
℃处理
1 h
，还原二硫键，然后加入
IAM
至终浓度为
55 mm
，暗室静置
45 min
，加适量预冷
过的丙酮，
-20
℃沉淀
2 h
，
25 000 ×g
离心
20 min
，
倒掉上清液，加入
200 μL 0.5 M TEAB
，超声溶解
15 min
，
25 000 ×g
离心
20 min
，取上清，
-80
℃保
存备用。
Bradford
定量并用
12% SDS-PAGE
检测总
蛋白提取质量。
3.5.3
嗜根考克氏菌的差异蛋白组学分析
蛋白质
iTRAQ
标记
(
马良宏等
, 2015)
：取
100 μg
蛋白质样品，加入适量胰蛋白酶
(
蛋白：酶
=20:1)
，
37
℃条件下酶解
4 h
，照上面的比例再加一次胰蛋
白酶，
37
℃条件下酶解
8 h
，利用真空离心泵抽干
肽段，用
0.5 M TEAB
再次溶解肽段，然后开始
iTRAQ
标记，不同组肽段用不同的
iTRAQ
标签来
标记，在室温条件下培养
2 h
，把标记过的各组肽
段混匀，通过
SCX
柱完成液相分离，最后进行
Nano
LC-MS/MS
分析。质谱数据经
Data Analysis 4.0
软
件自动分析标峰得到
mgf
文件，利用
Mascot2.3.02
软件搜索数据库
K. rhizophila-NCBI (6 362 sequen-
ces)
进行蛋白质鉴定，肽段匹配误差控制在
0.05 Da
以下。然后，利用
iTRAQ
定量的
ratio
值
(
抗生素处
理组与对照组表达量比值的四个
ratio
值的平均值
)
和单样本
t
检验的
P
值，选出差异表达蛋白，其中
差异蛋白筛选条件为：在
2
次重复中至少有
1
次重
复中满足差异倍数
(≥1.2
或者
≤0.833)
和统计显著性
(p≤0.05)
，并且在剩余的重复中表达趋势保持一致。
最后，利用
Blast2GO
程序对分析得到蛋白分别进
行
GO(
基因本体论
)
、
COG(
直系同源簇
)
、
KEGG(
京
