分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1080-1086
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1080-1086
Copyright © 2016 BioPublisher 1081
到国内外学者广泛关注。
本实验室在前期研究中获得一株具有广谱抗
菌活性的炭样小单孢菌
JXNU-1(
M. carbonacea
JXNU-1)
，其发酵产物对革兰氏阳性细菌与革兰氏
阴性细菌均具有很强的抗菌活性
(
龙中儿等
, 2008a;
戴菲等
, 2011;
彭伟梦等
, 2013)
。同时，研究了炭样
小单孢菌
JXNU-1
发酵产抗生素的工艺，掌握了该
菌发酵产抗生素的条件及其作用规律
(
朱跃进等
,
2006)
建立了从该菌发酵液中分离纯化抗生素的方
法，该抗生素经初步分析确定为一核苷类抗生素
(
龙
中儿等
, 2008b) (
本研究将其定名为抗生素
JX)
，与
文献报道的炭样小单孢菌活性产物明显不同，但其
抗菌机理仍不清楚。
嗜根考克氏菌
(
Kocuria rhizophila
)
，原名藤黄微
球菌
(ATCC9341)
，是药敏实验的常用靶菌之一
(Tang and Gillevet, 2003)
。本研究以抗生素
JX
为研
究对象，以嗜根考克氏菌为靶菌，研究抗生素
JX
对噬根考克氏菌肽聚糖合成的影响，同时运用同位
素标记相对和绝对定量
(Isobaric tags for relative and
absolute quantitation, iTRAQ)
技术与纳升液相色谱
和串联质谱
(Nano liquid chromatography-tandem
mass spectrometry, Nano LC-MS/MS)
技术高通量地
筛选与肽聚糖合成相关的差异表达蛋白，并应用实
时荧光定量
-PCR
进行验证，为揭示抗生素
JX
的抗
菌机理提供实验依据，对炭样小单孢菌抗生素的研
发具有重要意义。
1
结果与分析
1.1
抗生素
JX
作用下嗜根考克氏菌的细胞形态
最低抑菌浓度是测量抗菌药物抗菌活性大小的
一个指标，试管二倍稀释法是测定抗菌药物最低抑
菌浓度的一种常见方法。本研究首先运用试管二倍
稀释法分析了抗生素
JX
对噬根考克氏菌的的最低
抑菌浓度
(Minimum inhibition concentration,MIC)
为
3.64 ug/mL
。然后考察了嗜根考克氏菌在最低抑菌浓
度的抗生素
JX
作用下的细胞形态，在抗生素
JX
作
用下，噬根考克氏菌的细胞体积明显增大
(
图
1)
。
1.2
抗生素
JX
对嗜根考克氏菌细胞壁含量的影响
实验分析了嗜根考克氏菌分别在
0
、
1/2MIC
、
4/5MIC
和
MIC
的抗生素
JX
作用下的细胞壁含量变
化，发现在一定的抗生素
JX
浓度范围内，嗜根考克
氏菌细胞壁的含量随抗生素
JX
作用浓度增加而呈现
上升趋势，当抗生素
JX
浓度达到
MIC
时，嗜根考克
氏菌细胞壁含量比对照组细胞壁增加了
76.5%(
图
2)
。
图
1
炭样小单孢菌抗生素
JX
对嗜根考克氏菌细胞形态的影
响
(×5 000)
Figure 1 Effect of the antibiotics JX from
M. carbonacea
JXNU-1 on morphology of
K. rhizophila
(×5 000)
图
2
抗生素
JX
对嗜根考克氏菌细胞壁合成的影响
Figure 2 Effect of the antibiotics on cell wall synthesis of
K.
rhizophila
1.3
菌体蛋白的提取与鉴定
本研究使用
iTRAQ
技术进行蛋白质相对定量，
所用质谱仪器是
Triple TOF 5600
。在本次实验中共
得到
327 366
张谱图，采用
Mascot
软件进行分析，
匹配到
77 809
张谱图，其中
70 346
张是
Unique
谱
图，鉴定到的蛋白计
1 780
个，
13 420
个肽段，其
中含有
12 178
个
Unique
肽段。
1.4
差异表达蛋白的筛选
用
iTRAQ
技术对蛋白进行相对定量时，当某
一蛋白质的丰度差异倍数大于
1.2
倍、同时假设检
验
(p≤0.05)
，则定义该蛋白是不同样品间的差异蛋
白。而当某一蛋白质的量在两样品间无显著变化，
那么该蛋白质丰度接近于
1
。本研究对上述鉴定到
的
1 780
个蛋白的差异倍数以
2
为底取对数，然后
做出分布图
(
图
3)
，居于横坐标
0
右侧为表达量上调
的蛋白，居于横坐标
0
的左侧为表达量下调的蛋白。
设定差异表达蛋白的筛选条件为在
2
次重复中至少
有
1
次重复满足差异倍数
(≥1.2
或者
≤0.833)
和统计
显著性
(p≤0.05)
，并且在剩余的重复中表达趋势保
持一致，得到差异表达蛋白质共
149
个
(P≤0.05)
，
其中，表达上调蛋白
106
个
(
上调倍数
≥1.20, P≤0.05),
