分子植物育种
(
网络版
), 2016
年
,
第
14
卷
,
第
1080-1086
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2016, Vol.14, 1080-1086
Copyright © 2016 BioPublisher 1085
都基因与基因百科全书
)
注释，得到蛋白的功能信
息。
3.6
差异表达蛋白
RT-PCR
分析
按照上述方法收集菌体，采用天根生化科技
(
北京
)
有限公司的细菌总
RNA
提取试剂盒
(DP430)
提取总
RNA
。取
2 ug
总
RNA
进行反转录，反转
录方法参照
TaKaRa
双链反转录试剂盒说明书。
RT-PCR
检测参照文献
(
黄雨薇等
, 2015)
：荧光定量
所用的内参基因为
16S rRNA
，利用
Primer 5.0
设
计引物
(
表
2)
；反应体系为
20 μL
：
PowerUpTM
SYBR Green Master Mix (2×) 10 μL
，上下游引物各
1.2 μL
，
cDNA 40 ng
，最后添加灭菌水至
20 μL
，
设
3
个重复样品；实时定量检测采用
StepOneTM
and StepOnePlusTM
荧光定量
PCR
仪
(ABI
，
USA)
进行，反应条件为：
95
℃预变性
2 min
，
95
℃变性
15 s
，
60
℃退火
30 s
，共
40
个循环；融解曲线测
定为从
60
℃到
95
℃，定量数据采用
△△
Ct
方法计
算得出，相对定量的结果为
2
－
△△
Ct
。当定量结
果
2
－
△△
Ct>1
时，即表示为蛋白
mRNA
的上调倍
数；当定量结果
2
－
△△
Ct<1
时，即表示为蛋白
mRNA
的下调倍数；当定量结果
2
－
△△
Ct=1
时，
即表示为蛋白
mRNA
表达量无变化。
表
2
实时荧光定量
PCR
的引物序列
Table 2 Sequences of qRT-PCR primers
引物名称
Primer
name
上游引物
(5′→3′)
Forward
primers(5′→3′)
下游引物
(5′→3′)
Reverse primers(5′→3′)
16S rRNA CCTTCGCCATCGGT
GTTCCT
CGGTTTGTCGCGTCT
GCTGT
MurG
AGGTCGCTGCCGTG
GGACTG
GGGGTGAACTGGGC
GTCGGT
3.7
分析方法
抗生素的最低抑菌浓度采用试管二倍稀释法
测定，具体方法见参考文献
(Sanders and Sanders,
1974;
曲径等
, 2015)
；细菌细胞壁含量采用湿量法
测定，具体方法见参考文献
(
彭伟梦
, 2010)
；蛋白质
含量采用
Bradford
法测定，具体方法见参考文献
(Bradford, 1976)
。
作者贡献
陈鹏是本研究实验工作的具体执行人，完成数
据分析和论文初稿的写作；黄运红和李非负责文献
查阅、实验辅助；李素珍负责部分实验操作；龙中
儿是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文
写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目
(31160029;
31360018)
和江西省自然科学基金项目
(20132BAB-
204007)
共同资助。
参考文献
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