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基因组学与生物技术(网络版), 2013 年, 第 2 卷, 第 7-10 页
Jiyinzuxue Yu Shengwu Jishu (Online), 2013, Vol.2, 7-10
http://gb.biopublisher.cn
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Tetra System 进行 SDS-PAGE 电泳(图 1)，该装置
由美国 BIO-RAD 公司生产，仪器使用步骤请参照
BIO-RAD Mini-PROTEAN® Tetra System 说明书。
图 1 BIO-RAD Mini-PROTEAN® Tetra 系统
Figure 1 BIO-RAD Mini-PROTEAN® Tetra System
2 培养基、化学试剂及配置
本实验用的 4xTris.HCl/SDS pH8.8 缓冲液、
40%（ W/V）丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 (29:1) 溶
液、TEMED 、 4xTris.HCl/SDS pH6.8 缓冲液、
Sangon 5xProtein Loading Dye 均购于上海生工生
物工程有限公司，无水乙醇、甘氨酸、SDS、Tirs
等购于国内各个生物试剂公司。
(1) LB 培养基：每升水中： Tryptone: 10 g; Yeast
extraction: 5 g; NaCl: 10 g; Agar (if desired): 15 g;
用 5 M NaOH 溶液调整培养基的 pH 值为 7.0，然
后高压灭菌(121 ℃, 20min)。
(2) NB 培养基：每升水中：Peptone: 5 g; Beef
extract: 3 g; NaCl: 5 g; Agar (if dsired): 15 g; 用 5
M NaOH 溶液调整培养基的 pH 值为 7.2，然后高
压灭菌(121 ℃, 20min)。
(3)过硫酸铵(Ammonium persulfate ， APS)：称取
0.05 g APS 溶于 500 μL milli-Q 超纯水中。
(4) 1×电泳缓冲液：Tris 3.03 g 、甘氨酸 14.41 g、
SDS 1 g、蒸馏水定容至 1 000 mL。
(5)考马斯亮蓝染色液：Milli-Q H 2O 450 mL，乙醇
450 mL，冰乙酸 100 mL ，考马斯亮蓝 R250 1 g。
(6)脱色液：150 mL 冰乙酸与 850 mL 蒸馏水。
3 实验流程
3.1 准备样品
(1) LB 平板培养基上划线分离单菌落，于 30 ℃恒
温培养 18 h。
(2) 用接种环挑取单菌落于 5 ml LB 培养基中，
28℃，200 rpm/min 培养 12 h。
(3) 取 1 ml 菌液接种到含 200 ml NB 培养基的 500
ml 锥形瓶中，28℃，200 rpm/min ，摇床培养。
(4) 在 72h 的培养过程中，每 4h 取 1mL 菌液，置
于-20℃保存待用。
3.2 蛋白提取
(1) 4℃，12,000g，离心 10 min 收集伴胞晶体和芽
孢混合物(the spores and crystals)。
(2)沉淀用等体积冰冷的的 1 M 的 NaCl 洗涤 3 次。
(3)按照仪器操作，超声波破碎细胞处理 20 min
(model VC-130, Sonics and Materials Inc, USA)。
(4)最后溶于适量 5 mL 的 50 mM 的 NaCO3 溶液
(pH 10.0)中或者 ddH2O 中。
(5)蛋白的浓度用 BCA (bicinchoninic acid) protein
assay kit 进行标定，以 BSA 蛋白作为标准浓度蛋
白，具体操作按照产品说明书要求进行(Tiangen,
Beijing, China )。
3.3 SDS-PAGE 电泳胶的制备
分离胶组成如表 1，浓缩胶组成如表 2。电泳
设备为 Bio-Rad Mini-PROTEAN® system，玻璃板
的装配按说明书进行，每块 1.5 mm 厚度的凝胶需
分离胶溶液 7.5 mL，注入薄板之间后加入 300 μL
无水乙醇封顶，以使胶面平整。 25 ℃下静置
30 min，倾去无水乙醇，以滤纸条吸去残余的无
水乙醇，静置约 10 min 让乙醇完全挥发，然后配
制浓缩胶溶液。每块凝胶需 2 mL ，注入薄板间隔
后立即插入梳子，小心技巧的操作以防产生气泡，
静置 30 min 后，以保鲜袋包裹制胶架，25℃下聚
合 2 h 以上。凝胶完全、均匀的聚合，有利于提
高分辨率及减轻边缘效应。