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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1577
-
1582
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1577
-
1582
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1580
表
2
云南松
SSR
位点扩增参数
Table 2 The amplification parameters of SSR locus in
Pinus yunnanensis
位点
引物序列
(5'to3')
退火温度
*Na Ne
I
Ho
He
Fst
Locus
Primer sequence (5'to3')
Annealing temp-
erature
PR118
F: ACGTCCAACGGTCAGCTTAG
52.1
10 3.54 1.664 1 0.908 2
0.720 9
0.022 2
R: TCAAATGGCTCCAATTAGCC
PtTX3091 F: GTGGCCACCTGCTTATT
48.0
5 2.40 1.040 8 0.898 1
0.586 6
0.011 3
R: AACCCTTCCTATGACTATGG
PtTX3122 F: AAATCAAAGCAGCTAGAAAGTGT 58.1
4 2.81 1.178 5 0.791 2
0.647 6
0.169 6
R: AATATGCCTGAGGTTGGTTAC
RPTest11
F: AGGATGCCTATGATATGCGC
54.0
5 1.11 0.262 1 0.084 0
0.097 9
0.039 3
R: AACCATAACAAAAGCGGTCG
PTest1
F: CGATGTCGATTAGGGATTGG
52.0
10 2.81 1.254 3 0.327 7
0.647 2
0.424 6
R: CCTGTTCTTCGTCGGATGTT
PtTX4001 F: CTATTTGAGTTAAGAAGGGAGTC 53.8
17 4.51 1.942 9 0.709 7
0.782 6
0.029 4
R: CTGTGGGTAGCATCATC
PtTX3011 F: AATTTGGGTGTATTTTTCTTAGA
50.1
4 2.73 1.170 3 0.191 8
0.638 7
0.043 7
R: AAAAGTTGAAGGAGTTGGTGATC
平均值
7.9 2.8
1.216 1 0.558 7
0.588 8
0.105 7
Mean
注
: *Na:
观察等位基因数
; Ne:
有效等位基因数
; He:
期望杂合度
; Ho:
观察杂合度
; I: Shannon's
信息指数
; Fst:
遗传分化系数
Notes: *Na: Number of observed alleles; Ne: Number of effective alleles; He: Expected heterozygosity; Ho: Observed heterozygosity;
Expected heterozygosity; I: Shannon's information; Fst: Fixation index
et al., 2008)
；而杂合子的缺失在本研究中只有
2
个位
点表现明显，说明由杂合子的缺失引起的偏离
Har-
dy-Weinberg
不显著。虽然存在一定
Hardy-Weinberg
偏离，但本研究中，各位点间无明显的连锁不平衡，
且各位点检测出的等位基因数和有效等位基因数
平均达
7.9
和
2.8
个，完全可用于进一步的遗传分析
研究。此外，本研究所用引物数量较少，筛选出的多
态性引物较少，按
Koskinen (2004)
的研究表明，开展
群体研究时，需要增加引物的数量。因此，可进一步
通过基因组或
EST
序列开发
SSR
标记。
3
材料与方法
3.1
试验材料
初筛引物模板材料采集于白马河林场云南松
母树林种子播种获得的
2
年生实生苗，复筛引物模
板材料来源于云南松不同分布区的
5
个天然群体，
分别为：
KM (102.60
º
E, 25.07
º
N)
、
XW (104.05
º
E,
26.32
º
N)
、
FN (105.33
º
E, 23.42
º
N)
、
HQ (100.17
º
E,
26.29
º
N)
、
LX (100.15
º
E, 23.90
º
N)
等，先用每个群
体各
4
个个体进行多态性扩增检测，最后
5
个群体
各
24
个样进行
Hardy-Weinberg
和多态性分析。
3.2 DNA
的提取
云南松
(
Pinus yunnanensis
)
基因组总
DNA
采用
植物基因组
DNA
提取试剂盒
(
北京
Tiangen
公司
)
提
取，于-
20
℃下保存备用。
3.3
引物筛选
所用引物来源于同属种共
59
对，其中
47
对来
源于火炬松
(
pinus taeda
, PT)
，
11
对来源于辐射松
(
pinus radiate
, PR)
，
1
对来源于北美乔松
(
pinus
strobes
, PS) (Elsik et al., 2004; Elsik et al., 2001;
Zhou et al., 2002; Kutil and Williams, 2001; Devey et
al., 2002;
王鹏良
, 2006)
，引物由上海生物工程有限
公司合成，所用试剂包括
Taq
聚合酶
(83.35 mkat/L)
、
Mg
2+
(25.0 mol/L)
、
dNTP (
各
2.5 mol/L)
、
Marker
(DL2000)
、
10
×
PCR Buffer
等均购自
TaKaRa
公司，
其它试剂为国产分析纯。
PCR
产物加入
6
×
loading Buffer 2 µL
，混匀后
取
6 µL
，以
DL100 marker (TaKaRa
公司
)
为对照，
用
1.5 %
琼脂糖凝胶
(
含
EB 0.05 µg/mL)
，于
120 V
恒压下电泳
40 min (
北京六一仪器厂电泳仪
)
。电泳