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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1577
-
1582
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1577
-
1582
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1578
2011; Krapal et al., 2012)
而得到广泛应用，比如
Soto
等
(2010)
基于
SSR
标记分析气候变化对伊比利亚半
岛当地几种松的遗传结构的影响；
Eckert
等
(2010)
利用
SSR
标记研究表明不同的林分类型空间遗传
结构也不同。然而，为实现
SSR
高效扩增，除稳定
的扩增反应条件外，适宜的引物是实现有效或多态
扩增的关键，而引物的来源主要是利用已知序列根
据其两端较为保守的序列设计
(Krutovsky et al.,
2004;
陈怀琼等
, 2009)
或利用种间可转移性从近缘
种中筛选
(
尤卫艳等
, 2010)
，相比而言，后者是较快
捷的途径。
本研究以云南松实生苗基因组
DNA
为模板，对
来源于松属近缘种的
SSR
引物进行有效扩增和多
态性扩增筛选，对获得的多态性扩增引物，再用
5
个群体
120
个个体进行
Hardy-Weinberg
检测和多样
性扩增分析。
1
结果分析
1.1
引物退火温度对扩增产物的影响
SSR-PCR
扩增时的退火温度对扩增谱带式样
影响明显
(
张冬梅等
, 2007)
，常用一般程序和梯度降
温程序进行扩增以确定退火温度，在本研究中所采
用梯度降温程序
(94
℃
4 min, 94
℃
30 s, T<Tm
值±
5
℃
> 40 s, 72
℃
45 s, 35
循环
, 72
℃
10 min, 4
℃保存
)
确定各引物的退火温度。
由图
1
所示，
2
对引物各设置
6
个退火温度，随
着温度的逐渐提高
(
图中从左至右
)
，呈现出不同的
扩增效果，温度低，非特异性扩增较明显，随着温
度的增加，特异性增强，但超过一定温度范围则无
扩增产物。
图
1
同一引物不同退火温度的
PCR
扩增
Figure 1 The amplification result of the same primer in different
annealing temperature
1.2
多态性引物的筛选
1.2.1
多态性引物的选择
引物能否有效扩增主要根据条带的有无及清
晰度来判断。用单一样本对
59
对
SSR
引物进行初
筛，其中有
23
对引物能够在样品中扩增出片段，
再用
5
个云南松群体各
4
个个体样品
DNA
进行多
态性检测
(
荧光检测
)
，筛选出
7
对多态性引物。部
分引物的扩增结果如下图所示。
由图
2
可以看出，所筛选出来的引物在云南松
群体中扩增效果较好。
1.2.2
多态性引物的
Hardy-Weinberg
检测
对所筛选的
7
个多态性引物，采用
5
个云南松群
体
120
个个体进行
Hardy-Weinberg
检测，结果见表
1
。
Hardy-Weinberg
杂交过剩假设检验结果表明
(
表
1)
，
PR118
、
RPTest11
、
PtTX4001
在所有测试群
体中均处于
Hardy-Weinberg
平衡，
PtTX3091
和
PtT-
X3011
在所所有测试群体中未处于
Hardy-Weinberg
平衡；
PTest1
在
FN
和
HQ
群体、
PtTX3122
在
HQ
和
LX
群体中存在
Hardy-Weinberg
平衡，而在其它几
个群体存在
Hardy-Weinberg
不平衡。同时对连锁不
平衡的检测可知，各位点间无明显的连锁不平衡，
完全可用于云南松
SSR
分析。
1.2.3
多态性引物的多态性扩增参数分析
用
5
个云南松群体
120
个个体，对所筛选的
7
个
多态性引物进行多态性扩增参数分析，结果见表
2
。
从表
2
可以看出，
7
个位点在
5
个供试群体中共
检测出的等位基因数和有效等位基因数分别为
4~17
和
1~5
个，平均每个位点分别为
7.9
和
2.8
个。观察
杂合度和期望杂合度变化于
0.084 0~0.908 2
和
0.097 9~0.782 6
，平均为
0.558 7
和
0.588 8
；从位点水
平来看，
PTest1
和
PtTX3011
存在明显的杂合子缺失，
而
RPTest11
有微小的杂合子缺失，其余
4
个均未表
现出杂合子缺失；从整体水平来看，存在一定杂合子
缺失的现象。
2
讨论
微卫得位点可实现种间的可转移性，本研究中
采用的同属近缘种引物进行筛选，从
59
对引物中
共筛选出引物
23
对
(38.98%)
，从中筛选出多态性较
好的引物
7
对
(11.86%)
，相比同属马尾松
50%
的有
效扩增而言偏低
(
蔡娟娟等
, 2009)
，而与油松相比略
高
(
张冬梅等
, 2007)
，这种差异与引物的来源和扩增
树种间的亲缘关系远近有关，不同树种之间的亲缘
关系远近会对引物的通用性造成影响，因此要尽量
合成亲缘关系相对较近的引物
(
张冬梅等
, 2007)
。
各引物扩增结果
Hardy-Weinberg
检测表明，大
多数引物显著偏离
Hardy-Weinberg
检测，这可能是
由于零等位基因、有限的样本量和杂合子的缺失造
成
(Li et al., 2012)
。零等位基因即对微卫星位点进行
检测时，等位基因带型很弱甚至不能识别，位点与