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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1079
2
讨论
花生是重要的油料和经济作物，干旱导致的氧
化损伤是影响花生产量和质量的首要限制因子，因
此选育抗旱良种尤为重要。以往研究表明
SOD
活
性与抗旱性密切相关，在干旱胁迫下不同抗旱性品
种间
SOD
活性变化差异显著
(
张智猛等
, 2013)
。花
生
SOD
有
Mn-SOD
和
Cu/Zn-SOD
两种，
Chen
等
(2013)
人分离的花生类胚素蛋白
AhGLP2
有类似
Mn-SOD
的活性响应胁迫，其编码基因同时也上调
表达。花生
Cu/Zn-SOD
活性占
SOD
总活性
80%
以
上，且比
Mn-SOD
更稳定，对花生
Cu/Zn-SOD
的
研究为揭示其响应干旱胁迫及其对花生抗旱性的
贡献具有重要意义。
基因型决定了其抗旱性状对胁迫反应的敏感
程度
(Girdthai et al., 2010)
，干旱条件下花生不同品
种
SOD
活性变化的显著差异可能与其相关基因结
构密切相关。本研究对
4
个栽培品种细胞质
Cu/Zn-SOD
基因分析结果表明编码区存在等位变
异
(
表
2)
，并引起相应氨基酸残基的变化
(
图
4)
，这
些差异可能导致蛋白空间构型变化进而影响
SOD
活性水平。赵士诚等
(2008)
对玉米在胁迫下抗氧化
酶活性及其基因表达分析结果显示
SOD
活性主要
受基因转录水平调控。
花生野生种比栽培种具有更强的环境适应和
逆境耐受能力，野生种中丰富的抗性基因是栽培种
花生不可替代的宝贵资源，因此，探究花生属种间
亲缘关系一直以来都受到了研究者的广泛关注。栽
培种花生
(AABB)
为异源四倍体，目前较一致的观
点是
A.duranensis
(AA)
和
A.ipaensis
(BB)
为栽培种的
祖先种
(Moretzsohn et al., 2013)
。本研究对花生栽培
种和野生种
AhCSD1
序列分析结果显示山花
9
号
gShCSD1-1
和
gShCSD1-2
分别来自栽培种
A
、
B
两
个染色体组，并证明了
A.ipaensis
为栽培种花生
B
染色体组供体，
gShCSD1-1
与来自
A.duranensis
的
序列
gAduCSD1
同源性为
99.89%
。
花生
SOD
活性与抗旱性密切相关，抗旱型品
种具有更高的
SOD
活性。然而前人的研究多集中
于干旱胁迫下花生不同品种在不同生育期
SOD
活
性的动态变化，而对其相关基因及其转录水平研究
较少。因此，本研究对花生细胞质
Cu/Zn-SOD
基因
分子起源、品种间等位基因差异的研究为探究其基
因结构差异、转录水平与抗旱性的相关性，明确不
同花生品种的抗旱分子机理以及加快花生抗旱育
种具有重要意义。
3
材料与方法
3.1
材料
植物材料为
4
份栽培品种
(
表
1)
和花生区组二倍
体野生种
A.duranensis
、
A.kuhlmannii
和
A.ipaensis
。
Plant Genomic DNA Kit
、
RNAprep Pure Plant
Kit
、
Quant Script RT Kit
、
TIANgel Midi Purification
Kit
等均购自天根生化科技有限公司；
pEASY
-T1
Cloning Kit
、大肠杆菌菌株
DH5α
、
Tag
酶、
dNTP
等购自北京全式金生物技术有限公司；引物由上海
生物工程有限公司合成，测序工作由北京六合华大
基因科技有限公司完成；试验所需其它药品试剂均
为国产或进口分析纯。
3.2
方法
3.2.1 DNA
、
RNA
提取及
cDNA
链合成
依据提取试剂盒步骤分别提取花生栽培品种
与野生种幼嫩叶片
DNA
、
RNA
。以
2 μg RNA
为模
板，
Oligo(dT)
为引物，依照反转录试剂盒操作说明
合成
cDNA
第一链。
3.2.2
AhCSD1
的
PCR
扩增及测序
以报道序列
(DQ097721)
为模板，利用
Primer5.0
结合
Oligo6.0
软件设计特异性引物
CSD1-F
：
GCTTCTTTCCCTTCTCAGTCAA
与
CSD1-R
：
CACGCGAAAAAGCATGATAATC
。以
cDNA
为模
板，
PCR
扩增程序：
94
℃预变性
5 min
；
95
℃变性
30 s
，
54
℃退火
30 s
，
72
℃延伸
30 s
，
35
个循环；
72
℃后延伸
7 min
。以
DNA
为模板，
PCR
扩增程序：
94
℃预变性
5 min
；
95
℃变性
30 s
，
54
℃退火
30 s
，
72
℃延伸
2 min
，
35
个循环；
72
℃后延伸
10 min
。
PCR
产物经
1%
琼脂糖凝胶电泳，依据东金玉等
(2012)
试验方法回收目的片段、送样测序。
3.2.3
花生
AhCSD1
分子生物学特征分析
运用
DNAMAN
软件进行序列比对和翻译，利
用
MEGA(Tamura et al., 2011 )
软件采用采用最大简
约法
(Maximum Parsimony, MP)
构建栽培种与野生
种
AhCSD1
分子进化树，邻位相连法
(Neighbor-Joining,
N-J)
对
Cu/Zn-SOD
氨基酸序列进行聚类分析，均用
Bootsrap 1 000
评估分子树置信度。
利用
NCBI
在线工具
Splign (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/sutils/splign/splign.cgi?textpage =online&level=form)
分析基因内含子；
CD-Search (http://www.ncbi.nlm.