Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1057
DNA
。通过测定紫外光吸收值来确定
DNA
浓度和
纯度，并用
0.8% Agarose
胶检测电泳检查
DNA
完
整性。
3.2.2 AFLP
试验
(1)
酶切对所选样品采用
Eco
R
Ⅰ
/
Mse
Ⅰ双酶
切：酶切体系
(20 μL)
为：
10×T4 Buffer 4 μL
；
Eco
R
Ⅰ
(10 U/μL) 0.4 μL
；
Mse
Ⅰ
(10 U/μL) 0.4 μL
；模板
DNA
约
200 ng
；补
ddH
2
O
至
20 μL
。酶切反应条
件为
37
℃
3 h
，
65
℃，
3 h
。
(2)
连接连接体系
(20 μL)
为：
10×T4 Buffer 2 μL
；
Eco
R
Ⅰ
Adaptor (50 μmol/L) 1 μL
；
Mse
Ⅰ
Adaptor
(50 μmol/L )1 μL
；
T4 ligase 0.4 μL (5 weiss U/μL)
酶
切产物约
10 μL
；补
ddH
2
O
至
20 μL
。
(3)
预扩增反应体系：
2×PCR Mix 10 μL
；
E
00
0.5 μL
(20 μmol/L)
；
M
00
0.5 μL (20 μmol/L)
；连接模板
2 μL
；
加
ddH
2
O
至
20 μL
。
PCR
扩增程序为：
94
℃预变性
3 min
；
94
℃变性
45 s
；
50
℃复性
45 s
，
72
℃延伸
1 min
，
26
个循环。
(4)
选择性扩增反应体系：
2× PCR Mix 10 μL
；
E
primer
1 μL (20 μmol/L)
；
M
primer
1 μL (20 μmol/L)
；模
板
DNA 5 μL (
预扩产物稀释
20
倍
)
；加
ddH
2
O
至
20 μL
。
PCR
扩增程序为：
95
℃预变性
5 min
；
95
℃
变性
35 s
，
65
℃复性
35 s
，
72
℃延伸
1 min
，
12
个循
环；
94
℃变性
30 s
，
56
℃复性
30 s
，
72
℃延伸
1 min
，
23
个循环。
(5)
电泳和染色电泳时，先在
90W
恒功率条件
下预电泳
30 min
，然后按样本编号从小到大的顺序
进行点样
(7.5 μL)
，
90 W
恒功率电泳
1.5 h
。染色方
式采用银染。
所用
Eco
R
Ⅰ酶以及所用接头、引物购自上海
英骏生物工程技术服务有限公司
,
Mse
Ⅰ酶、
T4
DNA Ligase
酶购自
Promega
公司。接头和引物序列
详见表
3
。
3.2.3
数据分析
选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以
“1”
和
“0”
分别记录条带的有无。在相同片段位置上有带
记为
“1”
，无带记为
“0”
。制作
0 /1
矩阵，作
0 /1
矩
阵输入
POPGENE1. 32
软件进行分析。计算个体间
Nei
相似系数
(Nei and Li, 1979)
，并用
NTSYSpc2. 10
进行
UPGMA
聚类分析。
表
3 AFLP
引物和接头序列
Table 3 Primers and adapters sequence for AFLP
接头与引物
Primers and adapters
序列
(5'-3')
Sequence (5'-3')
引物
Primers
序列
(5'-3')
Sequence (5'-3')
Eco
R
Ⅰ
adapter1
CTCGTAGACTGCGTACC
E44
GACTGCGTACCAATTCATC
Eco
R
Ⅰ
adapter 2
AATTGGTACGCAGTCTAC
E83
GACTGCGTACCAATTCTCA
E00
GACTGCGTACCAATTC
E84
GACTGCGTACCAATTCTCC
M00
GATGAGTCCTGAGTAA
E85
GACTGCGTACCAATTCTCG
E41
GACTGCGTACCAATTCAGG
E86
GACTGCGTACCAATTCTCT
E42
GACTGCGTACCAATTCAGT
M51C
GATGAGTCCTGAGTAACCAC
E43
GACTGCGTACCAATTCATA
M51G
GATGAGTCCTGAGTAACCAG
作者贡献
房义福、宋国防是本研究的实验设计和实验研究的执
行人；刘凤栾、吴晓星及姜莉华完成数据分析，论文初稿的
写作；姜楠南、王翠香参与实验设计，试验结果分析；房义
福是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论
文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由山东省农业良种工程
(
鲁科农社字
2007-217)
资助。作者感谢山东农业大学林学院孙居文教授对本研究的
技术支持与指导。
参考文献
Benson L.L., Lamboy W.F., and Zimmerman R.H., 2001,
Molecular identification of
Malushupehensis
(tea crabapple)
accessions using simple sequence repeats, HortScience,
36(5): 961-966
Chen H.X., Liu L.F., Qian G.Z., and Tang G.G., 2007,
Advances in classification for cultivars of crabapple
(
Malus
spp.), Liaocheng Daxue Xuebao (Journal of
Liaocheng University (Natural Science Edition)), 20(2):
57-61 (
陈恒新
,
刘连芬
,
钱关泽
,
汤庚国
, 2007,
海棠
(
Malus
spp.)
品种分类研究进展
,
聊城大学学报
(
自然科
学版
), 20(2): 57-61)
Cheng M.H., Zhang Y.G., Zhou Z.Q., and Li X.L., 2002, A
study on population differentlation of
malustoringoides
Hughes and origin of
M. setok
vass, Yunnan Nongye
Daxue Xuebao (Journal of Southwest Agricultural