Basic HTML Version
张杨等
: iTRAQ
技术在植物蛋白质组学中的应用
1049
含量，但这些物质会对
iTRAQ
技术产生影响，因
此在进行
iTRAQ
一般实验流程前，要对样品进行
预处理，以消除或减少对
iTRAQ
试剂的影响。可
通过多次丙酮沉淀、
PD-10
脱盐法等处理。除此，
在
iTRAQ
标记实验中要注意两点：一是不能使用
含有伯胺基的试剂，因其能与
iTRAQ
试剂反应，
使试剂失效；二是在标记前要保证水相不能大于
30%
，因为
iTRAQ
试剂会发生水解，所以水相的含
量要低。
3 iTRAQ
技术的优缺点
目前，对复杂体系中的蛋白质进行相对定
量 主 要有以下方法：传统的双向凝胶电泳
(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)
、荧光双向差
异凝胶电泳
(DIGE)
。这两种方法是先通过进行跑电
泳然后通过切胶选择差异变化点进行质谱分析来
获得数据。还有一类是通过对样品进行同位素标
记，经过液相色谱分离后，进行串联质谱得到结果，
如
ICAT
、
iTRAQ
技术等。其中，目前最常用的就
是荧光双向差异凝胶电泳和
iTRAQ
技术。
荧光双向差异凝胶电泳是首先将不同样品分
别进行不同的荧光染料标记，然后将各试验样品在
同一块凝胶上进行双向电泳，因此避免了使用不同
凝胶在操作上的偶然性和不平行性，大大提高了实
验的可靠性、重复性和结果的可信度。但其还是存
在很多缺点：一是由于凝胶电泳本身存在缺点，因
为蛋白质的分离受到蛋白丰度、等电点、分子量和
疏水性等的限制，对于低丰度蛋白、疏水性蛋白等
都难以进行有效分离；二是从电泳到质谱不能直接
联用，在人工酶切差异点时也会造成较大误差，费
时费力；三是所用荧光染料
Cy3
、
Cy5
对于鉴定含
赖氨酸少的蛋白质有一定的困难。
而
iTRAQ
技术作为一种新的蛋白定量技术，
能克服
DIGE
中的所有缺点，且相对于其他同位素
标记技术有以下优点
(
王林纤等
, 2010)
：
(1)
因
iTRAQ
试剂本身是等量的，同一多肽在被不同同位
素的
iTRAQ
试剂标记后，相对分子质量还保持不
变，具有相同质荷比的肽段通过叠加会增加相对丰
度，因此提高了检测的效率；
(2) iTRAQ
试剂能标
记所有蛋白，增加了可分析的肽段数量，也提高了
蛋白质鉴定的覆盖率和可信度；
(3)
质谱检测中，
低分子量区域的质谱定性和定量相对更加准确，而
iTRAQ
中报告基团的相对分子质量较低
(113~121)
，
提高了质谱检测的灵敏度和可靠性；
(4)
通过串联质
谱，可在一次串联质谱过程中获得报告基团所对应
的多肽丰度和蛋白质前体序列，达到同时比较、鉴
定蛋白质的目的，操作步骤更加简单，结果更加可
靠；
(5)
能同时处理高达
8
个的样品，在实验样品多
的情况下能减少实验次数、降低误差，使结果更可
靠，同时该试剂的标记效率更高，过程更简单；
(6)
试剂兼容性好，目前用于蛋白质组学研究的材料均
能用
iTRAQ
技术。
Wu
等
(2006)
比较了三种蛋白定
量方法
(
即
DIGE, ICAT, iTRAQ)
的优劣，结果表明
相对来说
iTRAQ
技术的灵敏度要高于其他方法。
但有些情况下，不同方法是可以相互补充的。
4 iTRAQ
技术在植物蛋白质组学中的应用
iTRAQ
技术在医学、动物学上的应用很是广
泛，用于研究不同病理的差异蛋白。而在植物研究
上还相对较少，主要集中在拟南芥、水稻、盐芥等
模式植物上。
Jones
等
(2006)
在应用
iTRAQ
技术来比较拟南
芥正常与
3
种不同细菌侵染下的磷酸化作用相关蛋
白的变化，结果鉴定出了
5
个相关蛋白
(
脱水蛋白
,
p23
分子伴侣
,
热激蛋白
81,
质粒相关蛋白
/
原纤蛋
白和二磷酸核酮糖羧化酶
Rubisco)
。
Fukao
等
(2011)
为揭示拟南芥在锌过量的条件
下的生长机制，通过应用
iTRAQ
技术对拟南芥根
进行蛋白质组学定量实验，鉴定出了
521
个蛋白，
其中还包括几种质膜相关蛋白。结果还显示出了蛋
白定量结果，如铁螯合还原酶量增加，部分
V-ATPase
下降等。通过研究还发现，过量的锌会导
致根毛的分枝和变形。
Lan
等
(2011)
也用
iTRAQ
技术研究了拟南芥在
缺铁条件下蛋白质的变化情况，通过比较缺铁
3 d
和对照的蛋白质，鉴定出了
4 454
个蛋白，其中
2 882
个蛋白被定量，找出了
101
个差异蛋白。这些蛋白
与呼吸作用、
S
腺苷甲硫胺酸的合成与再生、氧胁
迫反应等有关。
Owiti
等
(2011)
也用
iTRAQ
技术比较了采后
0 h
到
96 h
后木薯蛋白的变化情况，分别在采后前期鉴
定了
67
个蛋白，后期鉴定了
170
个差异蛋白。这
些差异蛋白包含有与生理衰败不是十分相关的蛋
白，如木薯亚麻苦甙水解酶、谷氨酸蛋白、甘氨酸
RNA
结合蛋白、果胶甲酯酶、脱氢抗坏血酸还原酶、
丙二烯氧化物环氧化酶等。为了确定这些蛋白的可
靠性，还选取了一些酶做活性鉴定。
Alvarez
等
(2009)
为了全面研究钙离子对芥菜