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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1048
凝胶电泳的缺点，还能进一步提高蛋白质定量的精
确度和可靠性，在动物、人类的研究中已得到广泛
的应用，而在植物上只有在拟南芥、水稻等模式植
物中有涉及
(Sui et al., 2013; Shetty et al., 2012; Fan
et al., 2011)
。为了使
iTRAQ
技术更好在植物蛋白质
组学中得到应用，本研究对
iTRAQ
原理，实验流
程、优缺点及近几年在植物蛋白质组学中的研究进
展进行了详细介绍，以期
iTRAQ
技术能为植物蛋
白质组学研究提供借鉴。
1 iTRAQ
技术原理
同位素标记相对和绝对定量
(isobaric tags for
relative and absolute quantification, iTRAQ)
是美国应
用生物系统公司
ABI
研发出的一种多肽体外标记
技术
(
王林纤等
, 2010)
，因其具有精确度高、重复性
好、能鉴定低丰度蛋白等特点，在拟南芥、水稻等
植物的蛋白质组学中已被广泛使用。
iTRAQ
试剂
(
罗治文等
, 2006)
是一种小分子同重元素化学物质，
包括三个部分：即报告基团
(reporter group)
、平衡基
团
(balance group)
和肽反应基团
(peptide reactive
group)
。其中，报告基团是相对分子质量相差
1
的
同位素，平衡基团是用来补充质量之差，使各个报
告基团和平衡基团组合在一起后的相对分子质量
相等，肽反应基团的相对分子质量均相等。根据同
位素个数的多少，目前有两种试剂盒：一种含有
4
种同位素标记试剂，一种含有
8
种同位素标记试剂。
可分别进行多达
4
种和
8
种不同样品的检测。
iTRAQ
试剂几乎可以标记所有蛋白因其中的肽
反应基团能连接
iTRAQ
试剂与肽段的
N
端及赖氨酸
侧链。同时，
iTRAQ
试剂的质量是相等的，即各标
签在标记同一肽段后分子量也相等，所以，在第一
级质谱检测结果中，不同样本中的相同肽段在质谱
图上都表现为同一个质荷比
(
罗治文等
, 2006)
。接着
通过串联质谱中的第二级质谱，将上一级分离出的
前体离子
(precursor ion)
碰撞诱导解离，使
iTRAQ
试
剂三部分之间的键断裂，并丢失平衡基团，从而产
生低质荷比
(m/z)
的报告离子产物，即诊断离子
(diagnostic ions) (
罗治文等
, 2006)
。诊断离子的相对
分子质量比较低，在二级质谱图中更容易与其他离
子区别开来，而多肽的相对丰度就是通过比较诊断
离子峰的峰高及面积来获得，使结果更加可靠。与
此同时，多肽内的酰胺键会发生断裂，产生
b
离子
和
y
离子，通过在蛋白质数据库中查询和比较对相
应的离子片段，就可以鉴定出其对应的蛋白质。
2 iTRAQ
技术实验流程
一般情况下，实验流程为：将样品还原、用半
胱氨酸封闭；与胰蛋白酶结合酶解蛋白；将酶解获
得的肽段进行
iTRAQ
试剂标记；将标记过的样品
混合并通过多维液相色谱分离；将得到的馏分进行
MS/MS
串联质谱检测及分析
(
谢秀枝等
, 2011) (
图
1)
。质谱检测目前最高级的是用
AB SCIEX Triple
TOF™ 5600
系统，然后用
Proteinpilot
等软件分析。
图
1 iTRAQ
技术流程图
Figure 1 The process of iTRAQ technology
因植物多含有多糖、酚等杂质，相比于动物提
取蛋白质来说，含量较少、纯度较低，因此在提取
时会添加类似硫脲、
SDS
、
DTT
等物质来增加蛋白