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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1224
pp.115-139; Jaspers and Kangasjärvi, 2010; Bartels
and Phillips, 2010; Jewell et al., 2010)
。高温、冷害、
干旱和盐碱等非生物胁迫对植物造成伤害的主要
表现为
:
氧化胁迫、生物膜破坏、渗透胁迫和蛋
白质变性
(
简令成和王红
, 2009,
科学出版社
,
pp.115-139; Jacquot, 2009; Ruelland et al., 2009)
。植
物通常通过调节形态、生理生化、分子和基因等水
平的变化来增强对非生物胁迫的抵抗能力，而脯氨
酸
(proline, Pro)
作为一种兼容性小分子
,
与水有较
好的亲和力
,
每升水中能溶解
1623 g
脯氨酸
,
并且
高浓度对细胞无毒性
,
对细胞的酸碱平衡无影响
(
刘学师等
, 2002; Xue et al., 2009; Lehmann et al.,
2010; Szabados and Savouré, 2010)
。研究表明
,
游离
的脯氨酸对植物细胞抵抗非生物胁迫中起重要作
用
,
而且，其越来越多新的生理功能正在被发现
,
近年来关于脯氨酸的调控机制研究倍受科学家的
关注
(Xue et al., 2009; Lehmann et al., 2010; Szabados
and Savouré, 2009; Verbruggen and Hermans, 2008;
Trovato et al., 2008)
。
然而，目前实验指导书中的脯氨酸的测定方法
使用期大都在
10
年以上
(
刘友良
, 1992,
农业出版社
,
pp.84-89;
邹琦
, 1995,
中国农业出版社
, pp.96-97;
李合生
, 2000,
高等教育出版社
, pp.258-260;
张志
良
, 1990,
高等教育出版社
, pp.259-260;
白宝璋和
汤学军
, 1993,
中国科学技术出版社
, pp.156-157;
龚富生和张嘉宝
, 1995,
气象出版社
, pp.256-259)
。
职明星和李秀菊
(2005)
对脯氨酸测定方法的显色时
间、酸性茚三酮与脯氨酸反应的关系、酸性茚三酮
溶液保存时间与贮藏温度的关系进行研究，但未对
标准曲线和样品取样量进行优化。
本文以水稻叶片为试验材料，首先对标准曲线
(
表
1;
图
1)
进行优化比较，获得
0
-
75
μg/mL
的脯氨
酸含量范围的标准曲线，
y=0.0359x
-
0.0095
，
R
2
=0.9983
。其次，利用未经耐旱处理和耐旱处理
30
d
的水稻材料，研究取样量与脯氨酸含量的相关性，
获得
0.1 g
最适取样量
(
图
2;
图
3)
。在此基础上，模
拟耐旱试验条件
(
图
4;
图
5,
沙土含水量及叶片水势
变化
)
，利用脯氨酸含量的不同范围的标准曲线和最
适取样量通过研究干旱胁迫处理下
CBF3
差异水稻
材料脯氨酸含量变化
(
图
6)
，比较不同标准曲线范围
对脯氨酸含量增加比例的影响
(
图
7)
。研究结果表
明：干旱胁迫处理下，
CBF3
的存在能显著促进脯氨
酸含量的增加并减缓植物水势的下降，而合适的标
准曲线范围对精确测定脯氨酸含量十分重要。
本研究通过对脯氨酸测定方法中的最适取样
量和标准曲线范围进行研究，并利用不同范围标准
曲线，结合逆境条件下的
CBF3
差异水稻材料的脯氨
酸含量变化，从而证明测定脯氨酸含量需要有最适
取样量和合适的标准曲线范围。研究为逆境条件下
植物脯氨酸测定提供较好的技术与方法。
3
材料与方法
3.1
试验材料
方法优化试验的取样材料早籼
15
由安徽省农
科院水稻所提供，含
CBF3
的转基因
2
和不含
CBF3
的转基因
5 NT (
为转基因
2
的野生型
)
由韩国明知大
学生命科学学院提供。
3.2
试验方法
3.2.1
脯氨酸测定
脯氨酸测定的方法参照
(
赵海泉
, 2008,
中国农
业大学出版社
, pp.21-25, 83-84)
进行修改，主要如
下：①提取液
3%
磺基水杨酸水溶液：称取
3.00 g
磺基水杨酸，溶解，定容至
100 mL
容量瓶中；②
反应液
2.5%
酸性茚三酮显色液：量取
13.8 mL
磷酸，
加水至
20 mL
，为
6 mol/L
磷酸，加
30 mL
冰乙酸，
混匀作为溶剂。称取
1.25g
茚三酮，置于
50 mL
棕
色容量瓶中，加入溶剂，
70
摄氏度水浴溶解
1 h
，
完全溶解后，冷却至室温，定容，转移于棕色瓶中
保存，此溶液在
4
℃下可存放
20 d
。③脯氨酸的提
取：将水稻叶片去除中脉，剪碎，精确取
0.1000 g (
最
适取样量见结果
2.1.2)
，置于
10 mL
具塞刻度试管
中，加入
5 mL 3%
磺基水杨酸溶液，盖紧试管塞，沸
水浴
10 min
。脯氨酸的测定：取出冷却至室温，取
2 mL
上清液于
20 mL
具塞刻度试管，加入
2 mL
冰醋酸和
3 mL
酸性茚三酮显色液，沸水浴
1 h
。取出冷却后，
加入
5 mL
甲苯充分振荡，避光静置
30 min
，以纯水
调零，在
520 nm
处测定吸光值。试验设
3
次重复，
误差值均小于
1%
。
3.2.2
干旱处理试验条件设计
参照张瑛等
(2012b)
。试验于
2012
年
4
月至
7
月在安徽省水稻遗传育种重点实验室完成。采用人
工盆栽控制水分的方法，栽苗用底部带孔的圆形盆
钵，其直径
20 cm
，上部直径
31 cm
，盆深
33 cm
，
盆钵则放在宽
40 cm
、长
60 cm
、高
30 cm
的长方
形塑料盆中，在每个圆盆钵底部放上
2
层滤纸，再
装入吸水性较好的经过清洗、烘干处理并先后过直