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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1220
性、解除氨毒和作为能量库调节细胞氧化还原势等
功能
(
王宝增
, 2011,
生物学教学
, 36 (11): 4-5)
。
在旱、盐碱、热、冷处理的逆境条件下，植物
体内脯氨酸的含量均明显增加
(
谢虹等
, 2011)
。植物
体内脯氨酸含量与植物的抗逆性能存在显著相关，
抗旱性强的品种的脯氨酸积累较多，因此脯氨酸含
量可以作为抗旱育种的主要生理指标
(
吴慎杰等
,
2003)
。另外，脯氨酸由于其亲水性极强，能增加原
生质胶体稳定性，降低细胞液凝固点，防止细胞脱
水
,
在低温条件下，植物组织中脯氨酸的大量存在
能提高植物的抗寒性，因此，可作为抗寒育种的生
理指标
(
王小华和庄南生
, 2008)
。
关于脯氨酸测定方法，国内外均有文献报道，
Abrahám
等
(2010)
介绍了
3
种脯氨酸测定方法，分
别为靛红试纸检测法、分光光度法和
HPLC
的氨基
酸分析法，其中，靛红试纸检测法主要用于大批样
品简单、快速筛选，但显粗糙，
HPLC
的氨基酸分
析法主要基于氨基酸浓度变化，精确好，但设备较
为昂贵。而分光光度法成本低、简单、快速，因而
最为常用。
针对分光光度法，通常情况下，采用磺基水杨
酸提取，在酸性条件下和茚三酮反应生成红色缩合
物，用甲苯萃取后，在
520 nm
处有最大吸收峰
(
职
明星和李秀菊
, 2005)
。
然而，脯氨酸的分光光度法测定存在一些问
题，主要表现：已有的标准曲线范围较小，利用
0
-
10 μg/mL
的标准溶液配制，可测脯氨酸含量的范
围在
0
-
10 μg/mL
，而一般的逆境试验中，脯氨酸含
量往往超过
15 μg/mL
，特殊情况甚至接近
75
μg/m
L
，
因而，已有的标准曲线范围不利于逆境处理后期脯
氨酸急骤变化的检测。另外，叶片的一般取样量在
0.2
-
0.5 g
，也不利于试验室小微量材料的重复取样
测定。
转录因子
CBF
(CRT/DRE-binding factor)
是植物
抗逆过程中一个重要的调节因子，其广泛存在于拟南
芥 、欧洲油菜、水稻、玉米、小麦等各类植物中，
其本身来源于
CBF
基因，能通过识别
COR
基因中的
CRT/DRE (C-repeat/dehydration-responsive element)
元
件启动
COR
基因转录
(
李科友和朱海兰
, 2011;
张瑛
等
, 2012a)
。韩国科学家
Oh
等
(2005)
将拟南芥
CBF3
基因转入粳稻品种
Nakdong (
转基因
5 NT)
中，并获
得含
CBF3
基因的转基因
3
和转基因
2
材料，进而
对含
CBF3
的转基因材料和对照转基因
5 NT
的苗
期
(
生长
4
周
)
进行干旱胁迫处理，结果表明
CBF3
基因能显著提高水稻耐旱性。但对干旱胁迫下
CBF3
与脯氨酸含量的相关性报道较少
(
张瑛等
,
2012b)
。
因此，本文通过对脯氨酸测定方法中的最适取
样量和标准曲线范围进行研究，并利用不同范围标
准曲线，模拟干旱条件，研究
CBF3
差异水稻材料
的脯氨酸含量差异。旨在为探明逆境条件下植物脯
氨酸的调控机制提供较好的技术与方法。
1
结果与分析
1.1
试验条件的优化
1.1.1
标准曲线的优化
根据赵海泉的脯氨酸测定方法
(
赵海泉
, 2008,
中国农业大学出版社
, pp.21-25, 83-84)
的
10 μg/mL
标准溶液进行改进，分别再配制
50 μg/mL
，
100 μg/mL
的脯氨酸标准溶液，按表
1
配制不同浓度的脯氨酸
标准溶液。
取
17
支
20 mL
具塞刻度试管，分别按表
1
加入
不同浓度的脯氨酸标准溶液，加入
2 mL
冰醋酸和
3 mL
酸性茚三酮显色液，混匀，沸水浴
1 h
，取出
冷却，加入
5 mL
甲苯，避光静置
30 min
，用纯水调
零在
520 nm
处测吸光值。试验平行
3
次，绘制
0
-
75 µg/mL
、
0
-
10 µg/mL
、
15
-
35 µg/mL
、
40
-
75 µg/mL
标准曲线
(
图
1)
。
从上图中可以看出，
如图
1B
，脯氨酸标准
曲 线在
0
-
10 µg/mL
范围内
R
2
=0.9997
，方程
y=0.0365x
-
0.0024
，相关性较好，但其范围延展到
15
-
35 µg/mL
时
(
图
1C)
，
R
2
=0.9974
，
R
2
降低，方程
y=0.0356x
-
0.0128
，截距变大，即产生误差，而当范
围延展至
40
-
75 µg/mL
时
(
图
1D)
，
R
2
进一步降低为
0.991
，方程
y=0.0387x
-
0.1716
，截距进一步变大，
表现为误差进一步增大。而
0
-
75 µg/mL
的脯氨酸标
准曲线
(
图
1A)
正好覆盖上述三段范围，且其
R
2
=0.9983
，明显高于
15
-
35 µg/mL
、
40
-
75 µg/mL
的
R
2
值，其回归方程为
y=0.0359x
-
0.0095
，截距较小。
因此，正好解决逆境条件下高脯氨酸浓度检测的准
确度问题。