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分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1017
此外，醋酸钾缓冲液加入量多与或少于
1/100
体积
均不能有效提取出完整的
RNA
。为什么只需要如此
少量的醋酸钾缓冲液就可有效去除多糖？这种情
况在前人的研究中尚未报道过类似情况，目前尚不
清楚具体原因。
3
材料与方法
3.1
试验材料
本研究选取野生材料
PI296341-FR (
Citrullus
lanatus subsp. Lanatus
)
作为实验材料。温室育苗，
常规管理。于
2011
年
5
月初在北京市农林科学院蔬
菜中心延庆农场露地定植。定植约四周后开始人工
授粉，做标记。常规西瓜栽培管理，
3
次生物学重复。
PI296341-FR
果实取样方法：于授粉后
10
、
18
、
26
、
34
、
42
和
50
天进行取样。每个时间点，每个
生物学重复取整齐一致的果实
2~3
个。取样方法：
每个时间点每个生物学重复取果实中心瓤。混合取
样。同时留部分果实中心瓤做预备实验用
(
筛选
RNA
提取方法
)
。样品液氮速冻后-
80
℃冰箱保存备用。
3.2
试剂
进口试剂：
Tris
，
SDS
，
PVP-40
，
2-mercaptoethanol
(2
-巯基乙醇
)
，
phenol (
水饱和酚
) (pH 4.5)
，
DEPC
，
CTAB
；国产试剂：浓盐酸，
EDTA-Na
•
2H
2
O
，氢氧
化钠，氯化钠，氯仿，异戊醇，无水醋酸钠，冰乙酸，
醋酸钾，氯化钙，无水乙醇，
LiCl
。
3.3
总
RNA
的提取
3.3.1
改良的
SDS
水饱和酚法
(1)
快速称取
5~6 g
冷冻样品，铝箔包裹投入液
氮中。液氮预冷研钵和研棒。将样品快速放入研钵、
敲碎、研磨。
(2)
取另一个研钵加入
15 mL TENS
提取缓冲
液，把样品粉末转移到
TENS
中，立即研磨充分混
匀。转入
50 mL
离心管，
11 000 g
，
4
℃离心
5 min.
(3)
将上清液转入另一个离心管。在新离心管中
缓慢加入
1/4
体积的-
20
℃储存的无水乙醇，之后再
加入
10~25 μL 5 mol/L pH 5.2
的醋酸钾缓冲液。轻轻
混匀，冰上静置
10 min
。
11 000 g
，
4
℃离心
10 min
。
(4)
将上清液转入新的
50 mL
离心管，加入等体
积
PCI (
用前摇匀
)
，手工彻底混匀。
11 000 g
，
4
℃
离心
20 min
。
(5)
重复上述步骤
(4)
一次。
(6)
小心转移上层水相至新的
50 mL
离心管，加
入
0.1
倍体积的
3mol/L (pH 5.2)
醋酸钾缓冲液和
2.5
倍体积的冰冷无水乙醇
(−80
℃预冷
)
，
−20
℃静置
1 h
。
(7)11 000 g
，
4
℃离心
20 min
，吸弃所有上清和
管壁残留水滴，并在管壁圈出沉淀所在位置。
(8)
空气干燥沉淀
20~25 min
，用
600 μLRNase-free
水溶解离心管沉淀。转入
2 mL
离心管。电泳检测
RNA
完整性，
NanoDrop2000
检测并记录浓度和质
量。-
80
℃保持备用
(
注
:
栽培西瓜提取步骤不同之
处是
TENS
混匀液直接加
PCI,
并且不需要加醋酸
钾和无水乙醇
,
其余同上面方法
)
。
3.3.2
改良的
CTAB
法
改良的
CTAB
法具体操作过程参考李映志等
(2009)
。
3.3.3
改良
LiCl
法
具体操作方法参考叶庆亮等
(2007)
。
3.4
总
RNA
的质量检测
RNA
纯度分析：取
2 μL RNA
，用
NanoDrop2000
检测并记录浓度和质量。根据
OD
260
/O
D280
，
OD
260
/OD
230
的值确定
RNA
的纯度。
取少量
RNA (5 μL)
与
1 μL
的
6x loading buffer
混匀。
1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测
(150 V
进样
, 80~90 V
电泳
;
约
25 min) RNA
的完整性。
作者贡献
刘景安是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完
成论文初稿的写作；郭绍贵和张海英参与论文的修改；宫国
义和任毅参与实验设计；许勇是项目的构思者及负责人，指
导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读
并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金
(30972015)
和北京市自然
科学基金重大项目
(5100001)
共同资助。
参考文献
Ainsworth C., 1994, Isolation of RNA from floral tissue of
Rumex Acetosa
(sorrel), Plant Mol. Biol. Rep., 12(3):
198-203
http://dx.doi.org/10.1007/BF02668741
Bahloul M., and Burkard G., 1993, An improved method for the
isolation of total RNA from spruce tissues, Plant Mol. Biol.
Rep., 11(3): 212-215
http://dx.doi.org/10.1007/BF02669847
Chang S., Puryear J., and Cairney J., 1993, A simple and