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范鹏珍等：一种更加安全的
Northern
印迹检测‘津田’芜菁中
microRNA
的方法
1208
图
5
测出灰度值并计算得到的最终结果
Figure 5 Final result after gray value measurement and
calculation
2
讨论
以上实验证明：
4%
琼脂糖凝胶
Northern
印迹
检测津田芜菁中
microRNA
的方法是可行的。该方
法既能够避免丙烯酰胺有毒、聚丙烯酰胺凝胶易碎
等缺陷，又能够省去清除胶孔析出的尿素以及预电
泳等步骤，还能够有效地分离目的条带，更加安全、
方便、易操作。
由于
microRNA
在总
RNA
中所占的比例极低，
故要保证足够的上样量。我们综合考虑上样量、胶
孔容量、提取
RNA
的浓度等因素，经过多次试验，
确定上样量
30 μg
，上样总体积为
20 μL
时效果更
好。由于先前在蛭石中生长的幼苗，会带有一些杂
质，导致提取的
RNA
样品纯度下降，因此我们使
用
1/2 Hogland
营养液进行培养，结果获得了浓度
和纯度都能够满足实验要求的样品。
预杂交后，可同时加入
miRNA(
如
miR a1)
探针
和内标
(U6)
的探针进行孵育，这样在同一张膜上可
以同时检测出目标
miRNA
和内标的条带，方便后
续的分析。
陆明华等的实验方案中，显影之后的杂交膜进
行探针剥离后于室温或-
20
℃冰箱中保存，可用于
再次杂交，且检测顺序一般从低丰度到高丰度的
RNA (
陆明华和刘默芳
, 2010,
中国细胞生物学学报
,
32(2): 195-196
)
。而我们经过多次试验，发现丰度较
大的内标
U6
即使在进行探针剥离后，经过洗膜、
显影，仍然有
“
大量
”
的残留。由于
miRNA
的条带
均在
22 nt
左右，如果一个丰度相对较低但能检测
出条带的
miRNA
杂交后进行探针剥离仍有残留的
话，用同一张膜做另外一个丰度相对较高的
miRNA
的杂交时，必然会影响其实验结果；如果一个丰度
相对较低的
miRNA
杂交后没有检测出条带，剥离
探针后可以用于检测另外一个丰度相对较高的
miRNA
。故我们认为，做
miRNA Northern
印迹的
膜一旦检测出一个
miRNA
的条带，应该尽量避免
重复使用同一张膜进行另外一个
miRNA
的杂交，
以免探针剥离不彻底而影响实验结果。
3
结论
目前，
miRNA
的
Northern
印迹检测均使用变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离目的条带。由于探针
标记方式的不同，造成显影结果有很大差异；一般
来说，放射性标记要比地高辛标记的效果要好。但
从安全方面考虑，应选择使用地高辛标记的探针。
我们使用地高辛标记的探针，用
4%
的琼脂糖凝胶
分离目的条带，显影后的结果并不亚于用变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳来分离目的条带所得到的结果，而
且也比我们之前用变性聚丙烯酰胺凝胶来分离目
的条带显影得到的结果要好许多。因此，我们认为
4%
的琼脂糖凝胶结合地高辛标记的探针作为一种
更加安全的方法用于检测津田芜菁中的
miRNA
是
可行的。
4
材料与方法
4.1
材料
将野生型津田芜菁种子播种在
1/2 Hogland
培
养基上生长
3d
后，分别在
3
种不同条件下
(Control,
Treatment 1, Treatment 2)
处理
24 h
，处理完毕后迅
速包在锡纸中，液氮速冻后贮藏在
-80
℃冰箱中。
本文涉及到的各种缓冲液和试剂的配制参考
《现代分子生物学模块实验指南》
(
李玉花
, 2007,
高等教育出版社
, pp.14-35
)
和
Roche
公司的《
DIG
Wash and Block Buffer Set
》。
4.2
方法
4.2.1
总
RNA
样品制备
我们使用天根公司的
Phase Lock Gel
TM
Heavy
柱子配合
TRNzolA+
试剂提取总
RNA
；在
0.8%
琼
脂糖凝胶中电泳检测，用
Nanodrop2000
分光光度
计
(Thermal Scientific)
测定浓度后，每个样品稀释成
浓度
2 μg•μL
-1
，总体积
15 μL
，即上样量为
30 μg
。
样品保存于-
20
℃冰箱中备用。
4.2.2 4%
琼脂糖凝胶的制备
准备好长
12.5 cm
、宽
6 cm
的胶槽
(
保证胶足
够长
,
宽度根据样品多少调整
)
；称取
2 g
琼脂糖，
量取
50 mL 1× TAE
缓冲液，反复溶解至看不到
明显的颗粒为止
,
迅速用微量移液器加入
2.5 μL
EB (10 μg•mL
-1
)
，轻轻混匀，立即倒入胶槽中
(
高浓
度的琼脂糖胶很容易凝固
,
制备过程中操作要迅