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查中萍等：Bt 水稻 T1C-19 中外源基因的三引物多重 PCR 检测方法
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1.3 二引物体系扩增产物的序列分析
为了进一步验证二引物体系扩增产物是否为
目标基因序列，对引物 C1+C2 和 C1+C3 在 9311、
T1C-19 和 9311/T1C-19 中扩增出的片段进行测序
(图 3)。C1+C2 在 T1C-19 和 9311/T1C-19 中扩增出
的 DNA 片段序列完全一致( 图 3a)。对该序列进行
BLAST 分析，结果表明该序列与引物设计时所用的
GeneBank (HQ161062.1)中的 T1C-19 的基因组序列
相同，其中小写部分为 T-DNA 插入位点的侧翼序
列，大写部分为 T-DNA 序列。C1+C3 在 9311 和
9311/ T1C-19 中扩增出的 DNA 片段序列也完全一
致 (图 3b)。BLAST 分析表明，该片段来自于水稻第
11 染色体组(GeneBank: AC123519.2)，且与 T1C-19
的 T-DNA 插入位点的侧翼序列相同，其中大写部
分为 T-DNA 插入位点的左侧翼序列，小写部分为
T-DNA 插入位点的右侧翼序列。测序结果表明，引
物 C1+C2 和 C1+C3 的扩增结果与设计一致，均扩
增出目标片段。
图 3 二引物 PCR 体系扩增产物序列分析
注: a: C1+C2 在 T1C-19 和 9311/ T1C-19 中扩增出的 DNA 片段序列, 小写部分为 T-DNA 插入位点的左侧翼水稻基因组序列,
大写部分为 T-DNA 序列, 横线部分分别为引物 C1 和 C2 位置; b: C1+C3 在 9311 和 9311/ T1C-19 中扩增出的水稻基因组序列
片段, 大写部分和小写部分的交界处为 T1C-19 基因组中外源 T-DNA 的插入位点, 横线部分分别为引物 C1 和 C3 位置
Figure 3 The sequence of PCR products with two-primer system
Note: a: The sequence of PCR product with C1+C2 PCR system in T1C-19 and 9311/ T1C-19, Lowercase part is the left flanking
rice genomic sequence of T-DNA, uppercase part is the T-DNA sequence, the underlines indicate the positions of the primer C1 and
C2, respectively; b: The rice genomic sequence of PCR product with C1+C3 PCR system in 9311 and 9311 / T1C-19, the junction of
uppercase part and lowercase part is the insertion site of T-DNA in T1C-19 genome, the underlines indicate the positions of the
primer C1 and C3, respectively
1.4 三引物多重 PCR 扩增体系的优化
本研究中两个目标片段的引物退火温度设计
相同，因此在二引物扩增的基础上，按照原有 DNA
模板浓度、dNTP、 DNA 聚合酶用量，而引物 C1、
C2、 C3 按 2:1:1 用量配置三引物 PCR 扩增体系。
结果发现两个片段有不对称扩增现象。在此基础上
改变 DNA 模板浓度及扩增循环数，发现两个目标
片段的不对称扩增现象仍然存在。结合三引物多重
PCR 扩增体系中存在 1 个正向引物 C1 和 2 个反向
引物 C2、 C3，引物之间的竞争会影响扩增效果。
为此，设计了 4 个不同引物使用量的 PCR 反应体系。
体系 1： 0.5 μL 10 μmol/L C1+0.4 μL 10 μmol/L