Basic HTML Version
分子植物育种
(
网络版
)
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online)
1107
性，种植
Bt
水稻既可以有效避免稻纵卷叶螟、二
化螟和三化螟对水稻的危害，又可以减少杀虫剂的
使用，减轻环境污染。水稻科学家们已经培育出一
系列的转
Bt
基因水稻如转
cry1A(b)/cry1A(c)
融合基
因水稻
T51-1
、
T9-3
，转
cry2A
基因水稻
T2A-1
，
转
cry1C
基因水稻
T1C-19
等
(Tu et al., 2000; Ye et al.,
2001a; Chen et al., 2005; Tang et al., 2006)
，这些
Bt
水稻为培育抗螟虫水稻新品种提供了种质资源。在
抗虫转基因水稻育种研究中，以
Bt
水稻作抗虫基
因供体，优良常规水稻品种
(
品系
)
作受体进行杂交
(
回交
)
选育，再利用分子标记对抗虫基因进行跟踪，
从而选育出抗螟虫的优良水稻新品种
(
品系
)
。外源
Bt
基因是否纯合是影响育种进程的一个关键因素。
目前所用的检测
Bt
基因的分子标记主要是根据导
入的外源基因片段序列设计的特异显性标记，该标
记只能检测目标基因的有无，不能区分杂合基因型
和纯合基因型，需要在下一代对基因型进行验证，
因此显性标记检测效率低，耗费时力
(
邓鸿铃等
,
2007; Tang et al., 2006; Yang et al., 2011)
。根据外源
基因及其插入位点侧翼序列设计多重
PCR
标记可
以有效的鉴别杂合基因型和纯合基因型，提高选择
效率，加快育种进程
(
欧阳波等
, 2006;
贾芝琪等
,
2009;
张焕春等
, 2012)
。
转
cry1C
基因水稻新品系
T1C-19
，无论是人工
接虫还是田间鉴定，基本不受稻纵卷叶螟、二化螟
和三化螟危害，是培育抗螟虫水稻新品种
(
品系
)
的
优良亲本
(Tang et al., 2006; Zheng et al., 2011)
。本研
究根据
T1C-19
中插入的外源基因左侧水稻基因组
序列设计
1
个正向引物
C1
，根据插入位点右旁侧水
稻基因组序列设计
1
个反向引物
C3
，在插入的外源
基因序列靠近左侧水稻基因组处设计
1
个反向引物
C2
。利用这
3
个引物进行多重
PCR
扩增，在非转
基因水稻和纯合转基因水稻中分别扩增出大小不
同的
1
个片段，在转基因杂合体中同时扩增出上述
2
个片段。因此该体系可以同时鉴定出转基因纯合、
转基因杂合和转基因阴性
3
种基因型，为利用
T1C-19
进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便
有效的基因鉴定技术。
1
结果与分析
1.1
内参基因的检测
利用内参
actin
基因引物对转基因水稻
T1C-19
，非转基因水稻
9311
、
R838
、宜恢
72
，杂
交
F
1
代材料
9311/T1C-19
、
R838/T1C-19
、宜恢
72/T1C-19
进行
PCR
检测，结果见图
1
。除了空白
对照外的所有水稻材料中均扩增出
303 bp
目标片
段。说明所用
DNA
模板和
PCR
扩增体系正常。
图
1
内参基因
actin
的
PCR
检测结果
注
: M: DL2000 marker; 1: H
2
O
，
2: T1C-19; 3: 9311/ T1C-19; 4:
R838/ T1C-19; 5:
宜恢
72/T1C-19; 6: 9311; 7: R838; 8:
宜恢
72
Figure 1 PCR result of the reference gene
actin
Note: M: DL2000 marker; 1: H
2
O; 2: T1C-19; 3: 9311/ T1C-19;
4: R838/ T1C-19; 5: Yihui72/T1C-19; 6: 9311; 7: R838; 8:
Yihui72
1.2
二引物
PCR
体系对转基因水稻材料扩增的特异性
以不同类型水稻材料
DNA
为模板，分别利用
引物
C1+C2
和
C1+C3
进行
PCR
扩增，结果见图
2
。
C1+C2
在转基因纯系
T1C-19
、转基因杂合体
9311/
T1C-19
、
R838/T1C-19
、宜恢
72/T1C-19
中扩增出
一条约
512 bp
的片段，在非转基因材料
9311
、
R838
、
宜恢
72
中没有扩增产物
(
图
2A)
。
C1+C3
在转基因
纯系
T1C-19
中没有产物，在转基因杂合体
9311/T1C-19
、
R838/ T1C-19
、宜恢
72/T1C-19
，以
及非转基因材料
9311
、
R838
、宜恢
72
中扩增出一
条约
386 bp
的片段
(
图
2B)
。该结果与设计的扩增产
物大小一致。
图
2
二引物
PCR
体系在水稻材料中的扩增
注
: M: DL2000 marker; 1: T1C-19; 2: 9311/ T1C-19; 3: R838/
T1C-19; 4:
宜恢
72/ T1C-19; 5: 9311; 6: R838; 7:
宜恢
72; A:
C1+C2
引物扩增结果
; B: C1+C3
引物扩增结果
Figure 2 PCR amplification with two-primer system in rice
Note: M: DL2000 marker; 1: T1C-19; 2: 9311/ T1C-19; 3:
R838/ T1C-19; 4: Yihui72/ T1C-19; 5: 9311; 6: R838; 7:
Yihui72; A: PCR of C1+C2 primers; B: PCR of C1+C3 primers