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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1396
-
1400
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1396
-
1400
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1397
选基因、类抗病基因序列。其中抗病基因同源序列
(RGA)
被广泛使用。
RGA
是一类结构上与
R
基因类
似的序列。有的
RGA
与
R
基因紧密连锁，有的
RGA
本身即是
R
基因。根据
RGA
的上述特点，
RGA
在
以下几个方面得到了应用：作为一种分子标记，用于
标记抗病基因
(
丁国华
, 2004)
，构建遗传图谱
(Bakker
et al., 2011; Niu et al., 2011)
、分子标记辅助育种
(Silva
et al., 2012)
以及种质资源分析
(
肖天霞
, 2006)
；将
RGA
作为探针，筛选基因组文库克隆抗病基因
(Feuilet et
al., 1997)
。
目前克隆
RGA
有两种方法：
PCR
扩增得到
RGA
，
数据库检索法预测
RGA (
张礼凤等
, 2009;
任鄄胜
,
2008;
尚世界
, 2009; Rossi et al., 2003)
。柑橘
RGA
研究亦有所开展。本文将对柑橘
RGA
的研究进展作
一综述，并对柑橘
RGA
的应用进行了探讨。
1 PCR
扩增得到柑橘
RGA
目前，获得柑橘
RGA
多采用
PCR
扩增的方法。
PCR
扩增的方法有两种类型：一种是根据
R
基因编
码的蛋白质保守结构域设计简并引物，对基因组
DNA
进行扩增，得到
RGA
；另一种是根据
R
基因
保守序列设计引物，对
cDNA
进行扩增，得到有表达
信息的
RGA
。
对基因组
DNA
进行扩增获得
RGA
是比较常用
的方法。
Deng
等
(2000)
根据
NBS
类抗病基因产物
的保守结构域设计
6
条简并引物，构建
4
个引物组
合，对柑桔属和枳属的属间杂种“
USDA17
-
47
”的
基因组
DNA
进行扩增，扩增产物的序列分析表明，
22
条序列属于
NBS-LRR
类
R
基因超家族，并开发
了与柑橘衰退病和根结线虫有关的
CAPS
标记。
Deng
等
(2003)
以“
USDA17
-
47
”为试材，根据水稻白叶
枯病抗性基因
Xa21
和番茄青枯病抗性基因
Pto
编
码的氨基酸保守结构域设计
2
条简并引物，最终克
隆获得
29
条柑橘蛋白激酶类
RGA
，且明确了各序
列以
1~3
个拷贝形式存在基因组中，利用引物步行
法获得
2
个序列的全长，具备
Xa21
蛋白的全部特征。
安然
(2010)
根据细菌斑点病基因
prf
和拟南芥霜霉
病基因
RPM1
编码的蛋白质保守结构域
NBS-LRR
设计
2
条简并引物，对构橼、贞橙、三叶、椮橙、宜昌
橙
25
-
86
、冰糖橙
6
个柑橘品种的基因组
DNA
进行
扩增，获得了
9
个
RGA
。
对
cDNA
进行扩增获得
RGA
的研究较少。谌
谋华
(2003)
根据已知抗病设计了
8
条引物，组成
15
对
引物，对枳壳、九里香、黄皮、国庆
1
号的基因组
DNA
及枳壳、九里香、国庆
1
号的
cDNA
进行扩增，获得
了
25
个
RGA
，并以其中的
RGAn
-
17
-
2
作探针，对
柑橘基因组
DNA
进行
RFLP
分析，
RGAn
-
17
-
2
在
枳壳、九里香、黄皮、国庆
1
号中都有若干同源片段。
黄代青等
(2004)
提取琯溪蜜柚花柱的总
RNA
，通过
逆转录合成其
cDNA
，根据
R
基因编码的蛋白质
NBS
保守结构域设计
2
条简并引物，对
cDNA
进
行扩增，获得大小约为
500 bp
的
PCR
产物，对连
接产物进行酶切归类，筛选得到不同类别的克隆
12
个，并进行了测序。通过序列同源比较分析发现，
其中有
10
个片段属于
NBS-LRR
类
RGA
，与已知
植物
R
基因相应区段的氨基酸序列的同源性为
11.5%~47.1%
。
目前
,
几乎所有已知柑橘
RGA
都是通过
PCR
扩
增的方法获得。这种方法对没有全基因序列且基因
组庞大的物种来说比较适宜，但不足之处是不能覆
盖全基因组的
RGAs
。急需采用新的方法满足柑橘
RGA
研究的需要。
2
数据库检索法预测柑橘
RGA
随着基因组学及生物信息学的发展，许多植物
的
EST
序列相继公布，并且一些物种基因组测序已
经完成，发展了数据库检索
(data mining)
的方法，即
从
EST
或基因组测序中利用生物信息学手段寻找
RGAs
，可以获得该物种全基因组的表达
RGA
。该方
法简单快速，信息量大，是预测
R
基因的有效方法，
已在大豆
(
张礼凤等
, 2009)
、甘蔗
(Rossi et al., 2003)
、
小麦
(Dilbirligi and Gill, 2003)
、玉米
(Xiao et al., 2006)
、
水稻
(
肖天霞
, 2006; Wang et al., 2005)
等作物上成功
应用。目前在柑橘上尚未见利用数据库检索法获得
RGA
的报道。柑橘的基因组较小，基因组测序已经
完成
(www.phytozome.net; http://citrus.hzau.edu.cn/
orange/)
。若用数据库检索的方法在全基因组水平上
克隆柑橘
RGAs
，将提供一个通过
RGA
途径高效克
隆柑橘
R
基因的技术平台，会大大加快柑橘抗病基
因研究的进程。
3
柑橘
RGA
的应用
Yang
等
(2001)
根据
NBS
保守结构域设计了一
对简并引物，对枳壳
BAC
文库进行扩增和酶切，获
得了一个
1.2 mol
的重叠群，其中包含了柑橘衰退
病抗性基因座。这个基因座的几个预测抗性基因与
水稻
Xa21
基因，番茄
Cf
-
2
基因以及拟南芥
RPS2
基因相似，可用于标记抗病基因。