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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1383
-
1389
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1383
-
1389
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
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原酶基因、氨基酸合成酶等，除此还涉及到基因的
转录和蛋白质的合成等生命活动；细胞结构基因所占
比例仅次于物质代谢基因，其中包含
60s
核糖体蛋
白、组蛋白、核仁蛋白、染色体、
GPI
锚定蛋白等；物
质转运相关基因所占比例
8%
，其中包含多种物质的
转运蛋白，如：硝态氮转运蛋白
(NRT)
、
K
离子通道、
氨基酸转移酶、磷酸转运酶以及
MFS
单糖转运蛋
白等；能量代谢相关基因占到了全部基因的
7%
，其
中包含丙酮酸脱羧酶、糖原合成酶、异柠檬酸裂合
酶、
GTP
环水解酶、糖基转移酶、
ATP
伴侣蛋白等；
其它还有抗性相关基因包含一些热激蛋白、细胞色
素
C
氧化酶、以及泛素代谢相关基因等。表
2
显示
的是部分所得片段的
Blast
结果。
2
讨论
抑制性差减杂交理论上只适用于两个样本间
的差异比较分析，而且要求样本间差异不可过大或
过小。本试验中，
ERM
真菌菌株
19
在初始浓度为
3.8 mmol/L
的
MMN
培养液中已生长
15 d
，其生长
所产生的次级代谢物势必导致培养液成分的变化，
且氮源终浓度不确定，为了避免硝态氮诱导培养液
与对照培养液成分差距过大，保证两种培养液的差
别在可控制范围内，本试验在菌株培养结束时，先
将菌丝转入新鲜铵态氮培养液重新培养
24 h
，之后
收集一部分菌丝作为对照，另一部分转入硝态氮培
养液中培养作为试验方，最终成功获得了硝态氮代
谢相关基因，说明该处理方法比较合理。
从所建文库中，我们共获得
3
条硝态氮转运蛋
白基因、一条硝酸还原酶基因和一条亚硝酸还原酶
基因，同时还得到
3
条氨基酸转运蛋白基因以及其
它与物质合成代谢相关的基因序列。其中硝酸盐转
运蛋白负责将外界硝酸盐转运至生物体内，这是生
物体硝酸盐利用的第一步。植物体内的硝酸盐转运
蛋白通常以多个成员组成的多基因家族的形式存
在，依据生理特性不同，被划分为高亲和性转运系
统
(high-affinity transport systems, HATS)
和低亲和性
转运系统
(low-affinity transport systems, LATS)
，当
外界硝酸盐浓度较高时
(>1 mmol)
，低亲和性转运系
统起作用，当浓度较低时
(<250 µmol)
，高亲和性转运
系统起作用。本试验氮浓度设为
100 µm/L
，硝酸盐
转运蛋白基因共出现
6
次，说明此低浓度氮素条件
下该基因的表达量很高，推测次
ERM
真菌的
NRT
属于高亲和转运系统家族成员之一，这仍需要生理
和分子试验证据证明。由于硝酸盐中的氮为高度氧
化态氮，在参与合成体内多数还原态氮化合物之
前，必须先被还原为还原态的氨，而硝酸还原酶和
亚硝酸还原酶是该过程中的关键酶和限速酶，硝酸
还原酶负责将硝酸盐还原为亚硝酸，亚硝酸经亚硝
酸还原酶再还原为铵盐。菌根真菌中还原为铵盐之
前的代谢过程很少被研究，但最近几年也引起了研
究者的注意，主要围绕的是外生菌根真菌中上述基
因的表达进行，证明了该类基因与植物基因不同，
它不仅受硝酸盐的诱导，无氮条件下其依然上调表
达
(Jargeat et al., 2003; Guescini et al., 2007)
，
ERM
真
菌中该类基因的表达模式与此是否相同还需进行
进一步的试验验证。铵盐后续代谢在
AM
菌根中的
研究比较深入，外生菌根真菌也有涉及，已被证实
AM
菌根真菌中铵盐的后续代谢是一系列酶促反应
的过程，其中涉及到多种氨基酸的合成和转运
(Govindarajulu et al., 2005; Montanini et al., 2006)
，
本研究中氨基酸转运蛋白共出现
4
次，共获得
3
条不
同
ESTs
序列；精氨酸是
AM
真菌氮素代谢的关键中
间产物，是氮素从根外菌丝进入根内菌丝的主要氮
素形态，而精氨酸很可能是与多聚磷酸盐一起转运
完成氮素从根外菌丝转至根内菌丝的过程
(Guescini
et al., 2007; Cruz et al., 2007)
，本研究中也获得两条
磷酸转移酶的
EST
序列，这些都说明
ERM
真菌可
能存在与
AM
菌根真菌同样的精氨酸转运模式。研
究中获得了很多未知基因，已知基因也大多数没有明
确的功能注释，
ERM
真菌利用硝态氮的代谢途径还
远未揭示，有待进一步研究。今后将针对筛选出的重
要差异表达基因采用实时定量
PCR
和
Northern
法进
一步进行验证
,
并进行全长基因的克隆及其表达和
功能分析，逐步揭示
ERM
真菌硝态氮利用的机制，
最终服务于植物菌根技术的应用。
3
材料与方法
3.1
材料
试验选取在硝态氮培养基上生长良好的
ERM
真菌“菌株
19
”作为试验材料。该菌株为子囊菌门
(
Ascomycota
)
、锤舌菌纲
(
Leotiomycetes
)
、粘毛菌科
(
Myxotrichaceae
)
、树粉孢属
(
Oidiodendron
)
真菌菌
株，分离自浙江华顶山采集的云锦杜鹃根系。
试验所用生化试剂均为国产分析纯，购自国药
集团；常用分子生物学试剂均购于鼎国昌盛生物技
术有限公司；
PolyA Tract Systems
Ⅲ
(Z5300)
购于