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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1354
-
1359
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1354
-
1359
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1357
对
EST-SS RP03
在菠菜雌、雄株基因组中出现多态
性。在雄性基因组中扩增出一条分子量大约
200 bp
的条带
(
图
1)
。
图
1 EST-SSRP03
引物对雌、雄基因组的
PCR
扩增结果
Figure 1 PCR amplification pattern of male and female genome
using EST-SSRP03 primer pair
2
讨论
2.1
菠菜
EST-SSRs
的分布特点
植物
EST-SSR
序列总的检出率和不同重复基元
的频率不仅取决于序列的冗余程度，也与搜索软
件、搜索标准和收集数据有关
(Yan et al., 2008)
。一
般情况下，当最小重复长度设置为
20 bp
时，大多植
物种类
EST
中
SSR
的检出率大约为
5% (Varshney et
al., 2005)
。本研究从
1 093
条菠菜
EST
序列中，检出
68
个
SSR
标记，检出率
6.22%
，略高于大多数植物报
道的检出率。
一般来说，
EST-SSR
标记在同一种属物种内具
有良好通用性
(Poncet et al., 2006)
。但不同种属物种
中重复类型出现的频率和所占比例有一定差异
(
常
玮等
, 2009)
。根据以往报道，三核苷酸
(trinucleotide
repeat, TNRs)
和二核苷酸重复类型
(dinucleotide
repeat, DNRs)
的
EST-SSR
最为常见。如
Varshney
等
(2002)
等报道在禾谷类作物中
TNRs
所占比例最高
(54%~78%)
，其次为
DNRs (17.1%~40.4%)
和
TTNRs
(3%~6%)
。另外在小麦
(Gupta et al., 2003)
、葡萄
(Scott et al., 2000)
、柑橘
(
江东等
, 2006)
、苜蓿
(Eujayl
et al., 2004)
、棉花
(
王长彪等
, 2006,
科学通报
, 51(3):
316-320)
中，都以三核苷酸重复为主。而本研究中
统计得到的菠菜重复基元类型分布以
DNRs
最多，
占总数的
32.3%
。在二核苷酸重复中，出现频率最
多的重复基元是
GA/CT
，这与在水稻、玉米、大豆、
高粱中得到的结果是一致的
(Li et al., 2008)
。
2.2
建立菠菜
EST-SSR
标记的潜力与局限性
与其它分子标记相比，
EST-SSR
标记具有很多
独特的优点。
EST-SSR
分子标记不仅可以用于遗传
多样性、物种起源进化及比较基因组学等研究，由
于
EST-SSR
直接来源于表达基因编码区序列，因而
如对不同表现型的同类物种间差异
EST-SSR
进行比
对筛选，在获得的特异性
EST-SSR
背后就代表着某
特异性表达基因，可进行功能基因的发现与定位相
关研究。本研究中，利用
EST-SSR
引物序列从雄性
基因组中扩增出一条分子量为
200 bp
左右的特异性
条带，因此推测该片段可能与菠菜性别分化相关，
这为菠菜性别分化基因的克隆及早期性别鉴定奠
定了基础。
目前，对菠菜进行
EST-SSR
开发与应用还存在
很多局限性。
NCBI database
数据库中收录的菠菜
EST
序列数目很少，仅有
1 093
条。而一些主要的粮
食或经济作物已收录的
EST
序列，已达几十万甚至
几百万条。在这些物种中进行
EST-SSR
标记的开发
结果也更丰富，更具有代表性。相信随着菠菜中新
的
EST
序列被发现，利用
EST
进行研究的前景将更
广阔。总之，本研究根据
NCBI
数据库中现有的菠菜
EST
资源，在明确了菠菜
EST
中的
SSR
信息后建立了
EST-SSR
标记并应用到菠菜性别分化的研究中。结
果表明，基于菠菜
EST
数据开发菠菜性别相关的
EST-SSR
标记的方法是切实可行的。
3
材料与方法
3.1
植物材料和
DNA
提取
菠菜植株取自河南师范大学生物科学学院实
验田。分别选取已知性别的雌、雄菠菜植株新鲜幼
叶，然后将其洗净、晾干，液氮中研磨，采用改良
的
2×CTAB
法提取
DNA
。
3.2 EST
序列获得和预处理
从
NCBI (
美国国立生物技术信息中心
)
数据库
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
中查找菠菜
EST
，共计
1 093
条
(
截止
2011
年
5
月
)
。对该
1 093
条
EST
序列，利用
在线软件
EST-trimmer (http://pgrc.ipk-gatersleben.de
/misa/)
除去其中的
ploy A/T
尾和载体等序列。并利用
在线软件
Repeat Masker (http://www.Repeat masker.
org/cgi-bin/WEBRepeatMasker)
搜索重复序列。
3.3
菠菜
EST
中
SSR
信息分析
利用在线软件
SSRIT (http://www.gramene.org/
db/markers/ssrtool)
搜索
SSR
。检索标准为二核苷酸、
三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复序
列重复次数分别大于或等于
8
、
5
、
4
、
3
、
3
。
3.4 EST-SSR
引物设计与合成
利用引物设计软件
Primer 3.0
设计了
7
对菠菜