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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1061
-
1066
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1061
-
1066
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1065
3.5
消减抑制文库的构建
3.5.1
连接
pMD18
-
T Vector
与第
2
轮
PCR
产物进行连接，
总体系
10 μL
，在
16
℃的条件下孵育
16 h
。
3.5.2
转化
取连接产物
2 μL
，加入
6 μL
的灭菌水，稀释
3
倍与
Takara
公司提供的感受态细胞
DH5α (50 μL)
结合，混匀后冰上静置
30 min
、
42
℃热击
90 s
，冰
上
2 min
后加入
800 μL
的
SOC
，
37
℃摇床培养
1 h
(230 r/min)
后取
80 μL
涂于含氨苄青霉素的
LB
培养
基上，
37
℃过夜培养。
将生长出来的白色菌斑，用已灭菌的牙签挑取
菌落，置于装有
2 000 μL LB
培养液的试管中，
37
℃
摇床培养过夜
(
转速为
230 r/min)
，保存菌液。
3.5.3
菌落
PCR
进行菌落
PCR
，用巢式
PCR
引物扩增插入片段，
检测片段的大小及有无。反应条件为：
95
℃
10 min
；
94
℃
30 s
，
68
℃
30 s
，
72
℃
1 min 27
个循环后，
72
℃延伸
10 min
。
3.6
克隆片段
DNA
同源比对及进化树构建
挑取
150
个克隆送上海生工测序，经过去除载
体和引物序列的净化处理后，得到
135
个唯一序列。
利用
NCBI
在线
Blast
同源比对并利用
MEGA
软件构
建进化树。
作者贡献
和凤美、田璐是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；武芸芸完成数据分析；朱永平参与实验设计，试验结果
分析；和凤美是项目构思者和负责人，指导实验设计，数据
分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金
(30860178)
资助。作者感谢
云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心
全体工作人员在本实验过程中的帮助。感谢同行评审人的评
审建议和修改建议。
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