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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1061
-
1066
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1061
-
1066
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1064
瓣的形成，第四类
DEF
基因控制唇瓣的形成。
“
兰花
密码
”
的提出是一个创新，但兰科植物种类繁多，
这一模型并不适用于所有兰科植物
(Tsai et al.,
2004)
。如郑至勤
(1996)
从姬蝴蝶兰中克隆到两个
E
类基因
PeMADS8
和
PeMADS9
，特异地在唇瓣中表
达，并在具有三唇瓣突变体的唇瓣中也有表达。郭
滨
(
郭滨等
, 2006)
从蝴蝶兰
(
P. hybrida
)
中克隆到三个
PI-like
基因，
RT-PCR
与原位杂交分析表明
phP19
、
PhPI10
和
PhPI15
均在蝴蝶兰的生殖发育阶段表达，
在营养，生长阶段不表达，
PhPI15
在所有花器官中
都表达，而
PhPI9
和
phPI10
仅仅在唇瓣表达。
本实验中有
2
个上调表达序列与
DEF
基因聚为
一类，
2
个上调表达序列与
PI
基因聚为一类
,
为平行
进化同源基因。这
4
个基因同时在蝶化捧瓣中上调
表达，与
“
兰花密码
”
分子模型有不一致性。由此可
以推测，兰花的高度特化的花部结构，涉及到比较
复杂的分子遗传机制。莲瓣兰名品
‘
苍山奇蝶
’
捧瓣
突变，有可能与这
4
个基因的过量表达有关，从而
表现出捧瓣蝶化现象。
近年来，不同实验室已从多种兰花中分离到多
个
MADS
基因的平行进化同源基因。说明
MADS
等
基因在兰花的成花转换及花器官形成过程中起重
要作用，与兰花结构的特异性及多样性有关。然而，
基因表达与花形态相关的试验证据还不够充足，基
因表达模式的保守性与特异性还需要深入研究
(
田
敏等
, 2011)
。本文对序列功能的预测是基于表达序
列标签分析，由于这些表达序列标签序列比较短，
不能代表基因的全长，所以只能得到部分的基因信
息。为了揭示
‘
苍山奇蝶
’
蝶化捧瓣变异分子机理，
为今后利用植物基因工程改良中国兰花的观赏性
状，我们还必须进行后续试验，根据这些
EST
序列
设计引物，通过
race
技术获得全长目的基因，以便
获得目的基因的结构、功能及其表达产物的特性和
完整的基因信息。这将为中国兰花花器官高度进化
的形态学发育提供分子基础，并有助于人们对其分
子调控的理解。
3
材料与方法
3.1
植物材料
从云南大理购买
‘
苍山奇蝶
’
植株，带回实验室
后，分别取尚未完全开放的
‘
苍山奇蝶
’
及其正格花
捧瓣，用干净的锡箔纸包裹后置于液氮
4 h
后，放入
-
80
℃冰箱保存待用。
3.2
主要试剂
RNAiso-mate for Plant Tissue
、
pMD18
-
T Vector
购自
Takara
公司；
PCR cDNA Synthesis Kit
、消减杂
交试剂盒购自
Clontech
公司；
Oligotex mRNA Mini
Kit
购自
QIAGEN
公司；
2K PlusII DNAMaker
购自全
式金生物技术有限公司。其它试剂均为国产分析纯
产品。
3.3
总
RNA
的提取及
mRNA
的纯化
按照
RNAiso-mate for plant Tissue
试剂盒的方
法，进行总
RNA
的提取。参照
Oligotex mRNA Mini
Kit
说明进行
Ploy A
+
mRNA
的分离、收集和纯化。
3.4
消减抑制杂交
3.4.1 cDNA
的合成及纯化
以
‘
苍山奇蝶
’
蝶化捧瓣为检测子，其正格花捧
瓣为驱赶子进行差减杂交。以
mRNA
为模版，
SMART 3' CDS Primer II A
为引物，在
PowerScript
Reverse Transcriptase
的作用下反转录出
cDNA
一链。
二链的合成参照
Advantage 2 PCR Kit
的说明进行，
循环参数为：
95
℃
1 min
；
95
℃
15 s
，
65
℃
30 s
，
27
个循环后
68
℃延伸
6 min
。二链
PCR
产物用酚
\
氯
仿抽提纯化，纯化产物放于-
20
℃冰箱保存。
3.4.2
酶切及酶切产物的纯化
用
Rsa
I
进行酶切。酶切体系为：
43.5 μL cDNA
、
5 μL 10× Rsa Restriction Buffer
、
1.5 μL
Rsa
Ⅰ
(10 U)
。
37
℃培养箱中孵育
3 h
。用
2.5 uL EDTA/Glycogen
混
合物终止反应。酶切产物用酚
\
氯仿抽提纯化。
3.4.3
消减杂交
在
1.5 μL
的
EP
管中分别加入
0.5 μL driver
cDNA
、
1.5 μL tester cDNA
和
1 μL
杂交缓冲液，将
混合液进行第
1
轮的差减，循环参数为：
98
℃变性
1.5 min
，
68
℃退火
8h
。第
1
轮杂交结束后，混合
2
份杂交液，加入新鲜变性的
driver cDNA
和
1 μL
杂
交缓冲液，
68
℃反应
12 h
。第
2
轮杂交结束后，将
溶液稀释于
200 μL
稀释缓冲液中，
72
℃保温
7 min
，
-
20
℃保存。
3.4.4 Nested PCR
以两轮杂交产物为模板，进行两轮
PCR
。第一
轮
PCR
条件为：
75
℃
5 min
，
94
℃
25 s
；
94
℃
10 s
，
66
℃
30 s
，
72
℃
1.5 min 27
个循环。第二轮
PCR
条件
为：
94
℃
10 s
，
68
℃
30 s
，
72
℃
1.5 min 27
个循环。
引物为：
Nested PCR primer 1
、
Nested PCR primer 2R
。