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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1559-1564
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1559-1564
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1562
明，在相同蛋白上样量的条件下，
PEG
沉降法显著
提高了
F
1
和
F
3
组分中低丰度蛋白质的可检测率，能
高分辨率地分离识别更多种类和数量的参与基因
表达调控的蛋白质，有利于质谱检测等后续分析工
作，为开展萝卜叶片蛋白质组学研究提供了良好的
技术支持。
3
材料与方法
3.1
材料
材料为本实验室保存的萝卜高代自交系
‘
NAUJLQX09
’，种植于塑料大棚中，常规管理，
进行蛋白提取实验时，分别选取植株真叶期叶片。
3.2
总蛋白质提取
3.2.1 Tris-HCl/TCA
-丙酮法
参照谷瑞升等
(1999)
方法，采用
Tris-HCl
粗提：
取萝卜鲜叶
1 g
，用
ddH
2
O
冲洗干净并擦干，加入叶
片质量
10%
的
PVPP
，在液氮中研磨，直至样品呈粉
末状后，再加入
Tris-HCl
提取缓冲液
4 mL (100
mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 100 mmol/L KCl, 50
mmol/L EDTA, 2 mmol/L DTT)
，在冰上静置
1 h
之
后，
4
℃
12 000 rpm
离心
15 min
；粗提后，取上清液，
加入预冷
10% TCA/
丙酮
10 mL
，
-20
℃冰箱中静置过
夜，
4
℃
12 000rpm
离心
15 min
，所得沉淀再用
10 mL
左右预冷的丙酮洗涤，在冰上静置
30 min
后，
4
℃
12
000 rpm
离心
15 min
，重复
3
次，第
3
次用
80%
预冷丙
酮，沉淀置于-
20
℃冰箱中冷冻干燥备用。
3.2.2 PEG
分级沉降法
按照
PEG
沉降法
(Xi et al., 2006; Acquadro et al.,
2009)
并适当进行简化：
Tris-HCl
粗提步骤同
3.2.1
，
粗提后，取上清液，加入
50% (w/v)PEG
储备液使其
终浓度达到
8%
，冰浴静置
30 min
，
4
℃
12 000 rpm
离心
20 min
，沉淀为蛋白组分
1 (Fraction 1, F
1
)
。上
清液中继续加入
50% (w/v) PEG
储液使其终浓度达
到
16%
，冰浴静置
30 min
，
4
℃
12 000 rpm
离心
20
min
，沉淀为蛋白组分
2 (F
2
)
。上清液加入
10 mL
预
冷
10%TCA/
丙酮，-
20
℃下静置过夜，
4
℃
12 000
rpm
离心
15 min
，沉淀为蛋白组分
3 (F
3
)
。分别用预
冷丙酮洗涤
F
1
、
F
2
以及
F
3
，
4
℃
12 000 rpm
离心
15
min
，重复
3
次，最后一次用
80%
丙酮，将
F
1
、
F
2
以
及
F
3
沉淀-
20
℃下冷冻干燥备用。
3.3
蛋白质样品溶解及浓度测定
将通过以上两种方法所提取的蛋白质粉末按
1:25
比例加入蛋白质裂解液
(7 mol/L
尿素
, 2 mol
硫
脲
, 65 mmol/L DTT, 4% CHAPS, 0.8%
两性电解质
Biolyte pH 3~pH 10)
，涡旋
1 min
后，
4
℃超声波助溶，
12 000 rpm
离心
15 min
，上清液即为蛋白质样品。
Bradford (1976)
法定量蛋白质样品浓度，分装样品，
放入-
80
℃冰箱备用。
3.4
电泳检测与图像采集
3.4.1 SDS-PAGE
在已知浓度的蛋白质样品中加入蛋白质上样
缓冲液
(0.062 5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS,
10%
甘油
, 0.05% β
-巯基乙醇
,
溴酚蓝
)
，使其终浓度
为
1 μg/μL
。分离胶浓度
12%
，浓缩胶浓度
5%
，预电
泳
30 min
，蛋白上样量为
10 μL
，室温下电泳，
15 mA/
胶，进入分离胶后，
30 mA/
胶，至溴酚蓝到达凝胶
底部停止电泳。电泳结束后银染
(Blum et al., 1987)
显色，利用数码相机照相，实验重复
3
次。
3.4.2
双向电泳
第一向等电聚焦
(IEF)
参照
BIORAD-PROTEAN
IEF CELL (Bio-Rad, USA)
等电聚焦系统指南进行。
17 cm pH 4~pH 7
固相
IPG
胶条，每根胶条蛋白上样
量为
1 000 μg
。
50 V
自动进行水化
12~16 h
后，设置
等电聚焦程序：
250 V
，
30 min
；
1 000 V
，
1 h
；
10 000
V
，
5 h
；
10 000 V
，
60 000 Vh
；
500 V
，保持。等电
聚焦结束后，将胶条置于平衡缓冲液Ⅰ
(6 mol/L
尿
素
, 20%
甘油
, 2% SDS, 0.375 mol/L Tris-HCl, 2%
DTT)
中平衡
15 min
，再置于平衡缓冲液Ⅱ
(6 mol/L
尿素
, 20%
甘油
, 2% SDS, 0.375 mol/L Tris-HCl,
2.5%
碘乙酰胺
)
中平衡
15 min
。第二向采用
Protein
Ⅱ
(BIO-RAD)
电泳槽，平衡后的胶条放置于
12%
聚丙
烯酰胺凝胶胶面上，低熔点琼脂糖封胶，开始电泳
时
15 mA/
胶，电泳
20 min
后，
30 mA/
胶电泳至溴酚
蓝离凝胶底部
1 cm
时停止电泳。考马斯亮蓝染色法
(Candiano et al., 2004)
染色，凝胶扫描后图像采用
PDQuest 8.0
软件进行分析，包括背景消减、蛋白点
检测以及匹配等，以获取清晰可辨的蛋白点，实验
重复
3
次。
3.4.3
质谱鉴定与数据库检索
参照
Shen
等
(2002)
的方法进行蛋白质点的胶内
酶解及肽段提取。采用
ABI MALDI-TOF/TOF 4800
质谱仪进行分析，采用反射模式，正离子谱测定获得
肽指纹图谱
(PMF)
，用
MASCOT
软件
(Matrix Science
Ltd., London, UK)
搜索
NCBInr
和
MSDB
数据库。