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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1549
-
1552
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1549
-
1552
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1551
的比率，克服了其它许多构建文库的方法中不能完
整地合成完整
mRNA
的缺点，被广泛接受和使用。
然而，欲将该技术应用于黄麻
cDNA
文库的构建，还
有几个关键的细节必须把握。首先，在利用酚
/
氯仿
进行抽提和乙醇沉淀的过程中，由于
cDNA
量少，为
了避免
ds cDNA
损失过多，研究者通常会尽可能多
地吸回水相，这种操作习惯通常使酚有痕量残留，
严重抑制随后
Sfi
Ⅰ的消化。所以，应避免过多地吸
回水相。在这个操作过程中，胶回收是较好的纯化
方式。其次，为了获得插入片段较大的高质量文库，
cDNA
酶切后分级分离产物的收集至关重要。如图
3
中的第
11
号管，虽然大多数片段长度能达到预期的
要求，但是，由于其中可能含有小于
300 bp
的片段，
从而影响文库的质量，故在操作中将其舍弃。
构建高质量的
cDNA
文库是开展功能基因组学
研究及克隆优良性状基因的前提。库容量和插入片
段大小是衡量
cDNA
文库质量的两个重要指标。在真
核生物中，要从一个
cDNA
文库筛选低丰度的
mRNA
，
一般要求文库滴度达到
5
×
10
5
pfu/mL (
刘铜等
,
2010)
，本研究所构建的文库滴度达
1.9
×
10
6
pfu/mL
，
具较高的覆盖度。在文库插入片段大小方面，一般而
言，插入片段越大，代表文库所包含的信息越完整。
本研究的插入片段在
0.5~2 kb
之间，暗示我们所构
建的文库具有一定复杂性和完整性。
本研究利用
CLONTECH
公司提供的
SMART
方法，首次构建了高效的黄麻
cDNA
文库，经滴度测
定、插入片段的
PCR
鉴定等均符合
cDNA
文库的
质量要求，本研究为构建分子标记连锁图谱的探针筛
选和进一步开展黄麻的
EST
测序分析、目的基因克
隆及功能基因组学研究奠定了基础。
3
材料与方法
3.1
供试材料
植物材料为黄麻
(
Corchorus olitorius
L.)
品种闽
引一号的种子，由福建农林大学祁建民教授提供。
3.2
黄麻总
RNA
提取
将湿滤纸置于培养皿上，取少量黄麻闽引一号
种子均匀撒于其上，在
25
℃左右萌发并生长
8 d
左
右。本研究按
Qiagen Plant RNeasy Kit (QIAGEN)
试剂盒提供的方法提取黄麻幼苗总
RNA
，材料用量
为
180 mg
左右。由于黄麻的
RNA
产量较少，本研
究连续重复使用
QIAGEN
的柱子两次，然后合并两
管，用紫外分光光度计测定
RNA
样品的浓度，并
用琼脂糖凝胶电泳检测
RNA
的完整性和相对浓度。
3.3
黄麻
cDNA
文库的构建
参照
SMART
Ⅲ操作手册，取
1 µg
的黄麻总
RNA
逆转录成
cDNA
的第一条链
(sscDNA)
。取
2 µL
第一链的
cDNA
为模板，经
LD-PCR
扩增合成黄麻
的
ds cDNA
。扩增的程序为：
95
℃
1 min
；
(95
℃
5 s;
68
℃
5 min)
×
20 cycle
。在
1%
凝胶上电泳检测结果。
将经过蛋白酶
K
消化和
Sfi
Ⅰ酶切后的黄麻
ds cDNA
，
用试剂盒提供的
CHROMA SPIN
-
400
柱对黄麻
ds
cDNA
的酶切产物进行分级分离
(
单滴收集
)
，电泳
检测并回收大于
0.5 kb
的部分，使用乙醇作进一步
沉淀和干燥处理后，溶于
7 µL SDW
中备用。取
1 µL
cDNA
与
λTriplEx2
载体置于
16
℃下连接反应过夜。
连接产物使用
Promega
公司提供的
Packagene
Lambda DNA Packaging System
进行包装，然后加
入
500 µL SM buffer
和
20 µL
氯仿至包装结束后的
产物中，混匀并离心，沉淀细胞破碎物。在试管的上
清中已含有
phage
，即为初级文库。为了后续研究方
便，在初级文库中加氯仿和
DMSO
后分装，每管为
5 µL
，置于-
70
℃中保存。
3.4
黄麻
cDNA
文库滴度与插入片段大小的测定
本研究采用倍比稀释计数法来鉴定文库滴度，取
5 µL
初级文库经
1
×
λ
稀释
Buffer
稀释
(10
倍
, 100
倍
和
1 000
倍
)
后；各取
10 µL
菌液用于文库滴度测定。
按照试剂盒说明书的方法，将经过鉴定的λ
TriplEx2
阳性克隆转化成
pTriplEx2
质粒克隆
(
宿主菌为
E. coli
BM25.8
菌株
)
。文库插入片段大小的鉴定采用
5'
和
3'
测序引物对克隆进行
PCR
扩增的方法进行。分别挑
取
86
个克隆于
86
个
(
含
5 µLH
2
O) 1.5 mL Epp-endorf
管中，于沸水中煮
5 min
后作为
PCR
扩增的模板，扩
增产物用
1.0%
琼脂糖凝胶电泳检测。
作者贡献
吴为人和谢小芳是本研究的实验设计和实验研究的执
行人；吴为人是项目的构思和负责人，指导实验设计和论文
修改；谢小芳是实验研究的执行人，完成试验和结果分析及
论文写作工作；陈燕萍参与实验材料的准备及文献收集和整
理工作；全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由福建省自然科学基金项目
(2012J01076)
资助，
在此表示感谢。
参考文献
Cai N.B., Huang X.W., and Zhuang W.J., 2007, Construction