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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1549
-
1552
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1549
-
1552
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1550
学研究及克隆优良性状的基因等奠定基础；同时，还
可以从文库中筛选构建分子连锁图谱的探针，这对
于遗传研究基础薄弱的黄麻而言，是一种快速而高
效的策略。
1
结果分析
1.1
黄麻总
RNA
提取
高质量的
RNA
是
cDNA
文库构建的必要前提，
因此黄麻总
RNA
的提取质量至关重要。由
RNA
的
凝胶电泳结果
(
图
1)
可以看出：黄麻闽引一号总
RNA
中含有
18S
和
28S
两条清晰的带，且
28S:18S
约为
2:1
，表明本研究所提取的黄麻总
RNA
完全符合构建
文库的标准。
图
1
黄麻闽引一号总
RNA
电泳
Figure 1 Electrophoresis of total RNA isolated from
Corchorus
olitorius
L. Minyin no.1
1.2 cDNA
合成
本研究采用
LD-PCR
扩增方法合成
ds cDNA
。该
方法在起始
RNA
大于
50 ng
就可以合成
ds cDNA
，
对起始模版量的要求极低。根据所提取的黄麻总
RNA
含量
(
约
400 ng)
，最终确定进行
20
个循环的扩增，从
而获得黄麻
cDNA
的第二链。电泳检测结果表明
(
图
2)
：扩增效果良好，
cDNA
大多弥散分布于
0.3~5 kb
之间，其中，在
1.0~2.5 kb
之间的条带最亮，说明这
个区域的
cDNA
分布最密集，该结果表明合成的
ds
cDNA
符合建库的要求。
1.3 cDNA
的分级
单滴收集分级分离的
dscDNA
，分别编号为
1~
17
，凝胶电泳检测结果
(
图
3)
。由图
3
可以看出：管
号
8
、
9
、
10
和
11
的条带信号最强。为了构建高质量
的文库，避免回收
300 bp
以下的小片段，本研究只收
集
7
、
8
、
9
和
10
四管的
dscDNA
，共收集
120 µL
。
纯化后用于下一步的连接反应。
1.4 cDNA
文库滴度和插入片段大小鉴定
通过倍比稀释计数法鉴定文库滴度，测定结果
为
1.9
×
10
6
pfu/mL
，可见所建的
cDNA
文库的滴度
达到了预期的要求。重组子插入片段的大小检测结果
表明
(
图
4)
：所建文库插入片段的大小大多居于
0.5~
2 kb
之间，比酶切产物的密集区
(1.0~2.5 kb)
略小，该
结果可能是由于载体优先与片段较小的
cDNA
连接
的缘故。然而，对于
EST
测序或探针筛选而言，这个
长度范围是适合的。
图
2
双链
cDNA
注
: M:
Hind
Ⅲ
/EcoR
Ⅰ酶切的
λDNA; 1:
闽引一号
Figure 2 Electrophoresis of ds cDNA
Note: M: λ-
Hind
Ⅲ
/EcoR
Ⅰ
digest DNAmarker; 1: Minyin no.1
图
3
黄麻
ds cDNA
经
CHROMA SPIN
-
400S
柱分级分离
注
: M:
Hind
Ⅲ
/EcoR
Ⅰ酶切的
λDNA; 1~17
为管号
Figure 3 ds cDNA of jute size fraction by CHROMASPIN400
Note: M: λ-
Hind
Ⅲ
/EcoR
Ⅰ
digest DNA marker; 1~17: Tube
number
图
4
部分重组子的检测
注
: M:
Hind
Ⅲ
/EcoR
Ⅰ酶切的
λDNA; 1~10
为插入片段
PCR
扩增的产物
Figure 4 The Detection of colonies
Note: M: λ-
Hind
Ⅲ
/EcoR
Ⅰ
digest DNA marker; 1~10: The
PCR product of insert size
2
讨论
在众多的
cDNA
文库构建方法中，本研究所使
用的
SMART
技术是一种较好的
cDNA
文库构建技
术，该方法利用逆转录酶
PowerscriptTMRT
的逆转
录和末端转移活性及内切酶
Sfi
Ⅰ的特性，可以在原
始材料较少的情况下
(
仅需
50 ng
的总
RNA)
，快速、
高效地构建各种生物材料的全长
cDNA
文库。该方
法能够大幅提高具有完整的
5'
末端克隆子在文库中