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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1542
-
1548
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1542
-
1548
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
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阳性，这说明在
PCR
检测时出现了假阳性。由此可
以看出，对转化植株进行分子检测时，还需要
Southern
杂交、
Northern
杂交、
Western
杂交等更精确的检测
手段进行更进一步的检测，来确定目的基因是否已
经整合到受体植株中
(
贺熙勇等
, 2008)
。
低温是限制植物分布影响产量的主要原因，对
植物冷害机理的研究表明：低温直接损伤膜结构，使
膜脂及功能蛋白受到损伤，从而破坏细胞正常的生
理生化过程，因此膜结构的稳定性与植物抗寒性直
接相关，
POD
和
SOD
作为内源活性氧清除剂能够
在低温逆境中清除体内过量的活性氧，维持活性氧
代谢平衡，保持膜结构的稳定性。从而消除或减轻
伤害
;
低温锻炼可使酶的活性增强，使植物免受低温
伤害，因而在低温逆境中
POD
和
SOD
活性的水平
与植物的抗寒性强弱有着十分密切的关系，并可作
为植物抗寒性检测的生理指标
(
张钰等
, 1998)
。
实验结果显示，转硅转运蛋白基因
OsLsi1
植株
的
SOD
和
POD
的活性均高于对照植株
,
从而在低
温胁迫下能够有效地清除细胞内过量的活性氧，保
持膜结构的稳定性，表明转基因植株在生理生化水平
上获得了有益的变异，并从生理生化水平上验证转
基因植株抗寒性的增强。同时通过检测发现转
OsLsi1
基因的植株抗逆性明显强于转化
OsLsi2
基
因的植株，可能是由于
OsLsi1
基因与植物从外界土
壤环境中吸收硅有关，可以提高植物吸收硅的效率，
增强植物抗逆能力；而
OsLsi2
基因与植物将自身的
硅向外界环境释放有关，使植物抗逆能力减弱。
随着分子生物学技术的飞速发展，运用基因工程
手段提高植物的抗逆性为抗性育种开辟了新途径
(
王侠礼
, 2005,
北方园艺
, 6: 14-15)
。在大豆、玉米、
棉花等农作物上
(
俞超等
, 2008,
江苏农业科学
, 4:
31-33;
曹桂艳和刘艳
, 2001)
，本研究利用农杆菌介
导法将
OsLsi1
、
OsLsi2
基因转入美女樱中，经过分子
检测之后测定相关生理指标，表明转基因美女樱的抗
寒能力得到了进一步提高，对培育抗寒美女樱品种。
3
材料与方法
3.1
植物材料、质粒及农杆菌菌株
美女樱
(
Verbena nybrida nybrida
)
，取自东北农
业大学园艺实验站。农杆菌
GV3101
，质粒
pBI121
由东北农业大学园林育种研究室保存。
pGEM-T
Easy Vector
购自
Promega
公司。
3.2
转基因植株
(
OsLsi1
,
OsLsi2
)
基因
PCR
、
RT-PCR
检测
移栽于温室的转基因再生植株长至
10 cm
高时
,
采用
CTAB
法提取转基因植株的叶片总
DNA
，根
据基因序列引物进行
PCR
扩增，
OsLsi1
基因序列
引物，
P1
：
5'
-
AGGGATCCTAGCCAGCCAGTGTTA-
GA
-
3'
和
P2
：
5'
-
TACGAGCTCACACGAACCACCA-
AGCAA
-
3'
，
OsLsi2
基因序列引物
P3
：
5'
-
AGGGAT-
CCAGGTGGTGGTCGATCGAA
-
3'
和
P4
：
5'
-
TACG-
AGCTCGCCAATTCAATTTCAAGCT
-
3'
，
PCR
反应
体系总体积为
25 µL
：模板
DNA 1 µL (
约
100 ng)
2 µL
，上、下游引物各
1 µL
，
Taq (5 U/L) 03 µL
，
dNTP
(2.5 mmol/L) 2.5 µL
，
Mg
2+
(25 mmol/L) 2.4 µL
，
10
×
Buffer 2.5 µL
，
ddH
2
O
补足
25 µL
。
PCR
反应程序：
94
℃预变性
7 min
，然后
94
℃
变性
30 s
，
55
℃退火
30 s
，
72
℃延伸
3 min
，
30
个循
环，最后
72
℃延伸
10 min
，
4
℃保存。扩增后取
10 µL
产物进行电泳检测。
RT-PCR
检测：采用硼砂
SDS
法提取
RNA
并
进行检测，以反转录后产物为模板，对转
OsLsi1
基
因、
OsLsi2
基因的植株进行
RT-PCR
检测，反应体系
及反应条件同
PCR
检测体系相同。
3.3
转
OsLsi1
、
OsLsi2
基因美女樱植株的低温胁迫
抗性检测
3.3.1
待测材料的低温处理
将未转基因与转基因植株分别栽种于营养钵
中，待幼苗长至
4~6
片真叶时，进行
0
℃低温处理
分别为
0
、
1 d
、
4 d
、
7 d
采样，每处理重复三次
,
然
后测其相关生理指标。
3.3.2
生理指标的测定
(a)
丙二醛
(MDA)
含量的测定：硫代巴比妥酸法
(
邹琦
, 2000,
中国农业出版社
, 173-174)
。
(b)
游离游离脯氨酸
(Pro)
含量的测定：酸性茚三
酮法
(
邹琦
, 2000,
中国农业出版社
, 161-162)
。
(c)
超氧化物歧化酶
(SOD)
活性测定：采用
NBT
法
(
李合生
, 2003,
高等教育出版社
, 191-205)
。
(d)
过氧化物酶
(POD)
活性测定：采用愈创木酚
法
(
李合生
, 2003,
高等教育出版社
,191-205)
。
上述实验均重复
3
次，并进行统计分析。
作者贡献
胡翠平、赵然和张美恒是本研究的实验设计和实验研究
的执行人；王秀刚、赵然和张焕完成数据分析；张美恒参与
实验设计，试验结果分析；胡翠平和樊金萍是项目的构思着
和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全
体作者都阅读并同意最终的文本。