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分子植物育种
(
网络版
), 2012
年
,
第
10
卷
,
第
1511-1517
页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1511-1517
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
1512
1986)
，每个亚基因家族都包含
6
个以上的成员
(Wettstein and Chua, 1987)
，两类亚基因家族内的同
源性为
94%~ 98%
，而家族间的同源性为
82%~84%
(Wettstein and Chua, 1987)
。
Sporamin
的表达具有块根特异性，与块根形态
器官的发生有着密切的关系
(Hattori and Nakamura,
1988; Hattori et al., 1991; Ohto et al., 1992; Takeda et
al., 1995)
，同时受到植株发育阶段和光合产物的调
控。
Sporamin
是甘薯块根特异贮藏蛋白，其启动子
也应具有块根特异性，克隆到该启动子，就可以构建
外源基因在甘薯块根中表达的载体，从而实现甘薯块
根特异表达外源基因的目的。为此，本研究根据已知
Sporamin A
基因序列设计引物，通过
PCR
扩增获得了
启动子片段，用克隆的启动子表达
GUS
基因并分析了
该启动子在烟草和甘薯植株的表达特异性。
1
结果与分析
1.1
片段克隆及生物信息学分析
采用川薯
34
总
DNA
为模板进行
PCR
扩增，得到
长为
1 100 bp
左右亮度较高的唯一条带，回收该
DNA
与载体
PMD19
-
T
连接，转化大肠杆菌
JM109
，
经行蓝白斑筛选，挑取白斑培养并测序分析，得到
了
1 144 bp
的
SpoA-p
片段
(
图
1)
。
图
1 SpoA-p
的克隆
注
: M: Marker
Ⅴ
; 1~4: 1 100 bp
的
SpoA-p
Figure 1 Clonging of SpoA-p
Note: M: Marker
Ⅴ
; 1~4
：
1 100 bp fragment of SpoA-p
PLACE
数据库
(A database of plant cis-acting
regulatory DNA elements)
在线分析表明：此启动子具
有核心启动子元件
CAATBOX1
，豌豆豆球蛋白基因
中此共有序列能控制组织特异性启动子的活性；元
件
SREATMSD
跟蔗糖表达相关；
959(
-
)CANBNNAPA
含序列
CNAACAC
，是油菜储藏蛋白启动子核心组
件，胚及胚乳中
napin
蛋白转录必须的调控因子，具
有特异性；
300(
-
)ELEMENT
在大麦醇溶蛋白及小麦
麦谷蛋白基因启动子的上游元件中也存在；
959(
-
)2SSEEDPR OTBANAPA
在很多储藏蛋白启
动子中存在，与储藏蛋白基因
Nap4
启动子的高活性
有重要的关联；
ACGTATERD1
和
ABRELATERD1
是干旱条件下黄化感应表达所必须的元件，转录调
控因子
ARR1AT
曾在水稻非共生的血红蛋白启动子
中发现；
CACTFTPPCA1
是
C4
植物叶片基因特异表
达的顺式调控元件；
359(
-
)WBOXNTERF3
在转录抑
制
ERF3
基因的启动子区发现存在，跟受创伤时激活
此基因有关；
265(
-
)CIACADIAN LELHC
是西红柿
生理节奏表达基因
DE
启动子的必须区域；
950(
-
)DOFCOREZM
是玉米
Dof
蛋白所需的核心位
点，此蛋白质只含有
1
个锌指结构，是植物所特有
的一类转录因子，其
N
末端保守的单锌指
Dof
结构域
是既与
DNA
又和蛋白相互作用的双重功能域；同时
还包含其他的功能组件
(
表
1)
。
1.2
载体构建
表达载体
PBI121
含启动子为
CAMV35s
的
GUS
基因，载体经
Hin
d
Ⅲ及
Bam
H
Ⅰ双酶切
CAMV35s
后
与
SpoA-p
相连，转化宿主细胞大肠杆菌
JM109
。提
取阳性质粒
DNA
，再用
Hin
d
Ⅲ及
Xba
Ⅰ双酶切检测，
得到
1 144 bp
的
SpoA-p
片段，证明构建成功
(
图
2)
。
图
2
双酶切鉴定
pBI121-SpoA-p:gus
Figure 2 Identification of pBI121-SpoA-p:gus by double digestion
1.3
烟草及甘薯转基因植株的获得
将含
SpoA-p
的农杆菌工程菌株导入烟草，经
3 d
共培养转入筛选培养基后叶片变成愈伤，愈伤经分
化逐渐长出小苗，待其长至
5 cm
时切下转入生根培
养基中，最终获得了
20
株抗性再生植株，筛选获得
的抗卡那霉素的植株的再生过程见图
3
。
将甘薯的叶片及茎段进行预培养后，与农杆菌
工程菌株
EHA105
：
pBI-SpoA-p::GUS
进行浸染，
30
min
去除菌液并在滤纸上吸干，共培养
3 d
进入筛选
培养阶段。
14 d
后叶片的边缘渐有突起，茎段两端
开始膨大，形成愈伤组织，转入分化培养基上后愈
伤分化出芽。随后幼苗叶片出现，将幼苗进行生根
培养，最终得到了
15
株再生植株
(
图
4)
。