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分子植物育种(网络版), 2012 年, 第 10 卷, 第 1505-1510 页
Fenzi Zhiwu Yuzhong (Online), 2012, Vol.10, 1505-1510
http://mpb.5th.sophiapublisher.com
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反应体系：10×LA PCR BufferⅡ(Mg 2+ plus) 2.5 μL，
模板 1.5 μL，dNTP Mixture (10 mmol/L) 1.5 μL，P1
和 P2 引物各 1 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.5 μL，ddH2O
12 μL；所用反应程序为：94℃ 5 min，94℃ 30 s，53℃
40 s，72℃ 1 min ，35 次循环，最后 72℃ 10 min ，
产物 4 ℃保存。回收 PCR 产物，连接载体并转化
感受态细胞，通过蓝白斑筛选及 PCR 阳性克隆鉴
定后测序。
表 1 WRKY4 克隆引物序列
Table 1 Primer sequences for WRKY4 cloning
引物 引物序列(5' -3')
Primer Primer sequences (5'-3')
P1 GAGTCCTAAGGGTTCACG
P2 CATACTTCCGCCATCTGT
3'GSP1 GCTTGTGCCTTATGTTGAGCCTGTGG
3'GSP2 TCTCAGGTGACGGATACAGATGGCGG
3'OUT Primer TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT
3'Inner Primer CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCAC-
TATAGG
5'GSP1 TCACCTGAGATTCCCACATCACCTGC
5'GSP2 CCACAGGCTCAACATAAGGCACAAG
5'OUT Primer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
5'Inner Primer CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATC-
AGTCGATG
F1 AGGAAGAAGAAATGGAAGAT
R1 GAAAAACAAAAGGAAGTAGC
3.4 WRKY4 基因 3'末端的克隆
根据中间片段的测序结果，用 Primer 5 软件设
计特异性引物 3'GSP1 (表 1)，为了提高产物特异性，
在 3'GSP1 下游设计一个巢氏引物 3'GSP2 (表 1)。通
用引物为 3'OUT Primer (表 1)，3'Inner Primer (表 1)。
参考 TAKARA 公司 3'RACE 试剂盒操作流程，
进行第一轮 PCR，20 μL 反应体系：ddH2O 5.25 μL ，
1×Cdna Dilution BufferⅡ 8 μL, 10×LA PCR Buffer
Ⅱ(Mg2+ plus) 2.5 μL, 3'GSP1 (10 μm/L) 1 μL, 3'OUT
Primer 1 μL, 3'cDNA 2 μL，LA Taq (5 U/μL) 0.25 μL。
PCR 反应程序中退火温度为 65℃，其他条件与克隆
中间片段所用程序相同。
选取第一轮 PCR 产物 2 μL 为模板，进行巢氏
PCR，dH2O 4.25 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)
9 μL，10×LA PCR BufferⅡ (Mg2+ plus) 2.5 μL，3'GSP-
2(10 μm/L) 1 μL，3'Inner Primer 1 μL，LA Taq (5 U/μL)
0.25 μL。反应条件与第一轮 PCR 相同。
巢氏 PCR 扩增产物经回收、克隆以及鉴定后，
进行测序。
3.5 WRKY4 基因 5' 末端的克隆
根据中间片段的测序结果，用 Primer 5 软件设
计特异性引物 5'GSP1 (表 1)，为提高产物特异性，
在 5'GSP1 上游设计一个巢氏引物 5'GSP2 (表 1)。通
用引物为 5'OUT Primer (表 1)，5'Inner Primer (表 1)。
实验操作过程参考 TaKaRa 公司 5'- Full RACE 试剂
盒说明进行。
第一轮 PCR 为 20 μL 的反应体系：1 ×cDNA Di-
lution Buffer Ⅱ8 μL， dH2O 5.25 μL， 5'OUT Primer
(10 μm/L) 1 μL，5'GSP1 (10 μm/L) 1 μL，5'cDNA2 μL，
10×LA PCR BufferⅡ (Mg2+ plus) 2.5 μL ， LA Taq
(5 U/μL) 0.25 μL。PCR 反应程序中退火温度为 60℃，
其他条件与克隆中间片段所用程序相同。
取第一轮 PCR 产物 2 μL 为模板，进行第二轮
PCR，dH2O 4.25 μL, dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)
9 μL, 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ plus) 2.5 μL, 5'GSP2
(10 μm/L) 1 μL, 5'Inner Primer 1 μL, LA Taq (5 U/μL)
0.25 μL 。PCR 反应中退火温度为 52℃，其他条件与
第一轮相同。将第二轮 PCR 产物经回收、克隆、鉴
定后测序。
3.6 WRKY4 基因全长的克隆
根据拼接得到的 WRKY4 全长序列设计特异性
引物 F1、R1 (表 1)，以总 RNA 反转录得到的 cDNA
为模板进行 RT-PCR ，反应程序与克隆中间片段的
PCR 程序相同，退火温度为 50℃。将 PCR 产物回收、
克隆、鉴定后测序。
作者贡献
徐岭贤是本研究的实验设计和实验研究的执行人；徐岭
贤及赵福宽完成数据分析；郝芮及孙清鹏参与实验设计，试
验结果分析；赵福宽是项目的构思者和负责人，指导实验设
计，数据分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最
终的文本。
致谢
本研究由北京市属高等学校人才强教计划资助项目
(PHR200907136)资助。
参考文献
Dong J., Chen C., and Chen Z., 2003, Expression profiles of